3-磷酸甘油含量检测

3-磷酸甘油含量检测技术指南

一、检测意义 3-磷酸甘油（Glycerol-3-phosphate, G3P）是糖代谢（糖酵解和甘油磷酸穿梭）与脂质合成（甘油三酯和磷脂）的核心中间体。其含量变化可反映：

• 能量代谢状态：如肌肉运动时的糖酵解强度
• 脂质代谢异常：如非酒精性脂肪肝中的甘油三酯合成
• 遗传代谢病：如甘油激酶缺乏症的诊断指标
• 细胞氧化还原平衡：参与NAD⁺/NADH循环

二、样本前处理关键点

三、主流检测方法详述 ▶ 酶偶联比色法（推荐方法） 原理（三步反应）：

1. G3P脱氢： G3P + NAD⁺ → 磷酸二羟丙酮 + NADH + H⁺ （甘油-3-磷酸脱氢酶, GPDH催化）
2. NADH显色： NADH + 碘硝基四唑氯（INT）→ 甲臜（Formazan） + NAD⁺ （心肌黄酶催化）
3. 比色测定： 甲臜在500-540nm处有特征吸收峰，吸光度与G3P浓度正相关

操作流程：

1. 配制反应体系（200μL）：
   • 50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)
   • 0.2mM NAD⁺
   • 1.0U/mL 心肌黄酶
   • 0.1mM INT
   • 待测样本/标准品
2. 37℃孵育5分钟
3. 加入0.5U甘油-3-磷酸脱氢酶启动反应
4. 37℃反应15分钟后，冰水终止
5. 540nm测定吸光度（OD值）

标准曲线制作： 用已知浓度G3P标准品（0-200μM）建立标准曲线，回归方程决定系数R²>0.99

▶ 液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS） 适用于复杂样本的高灵敏度检测：

• 色谱条件：HILIC色谱柱，流动相为乙腈/10mM醋酸铵水溶液(85:15)
• 质谱参数：ESI负离子模式，母离子m/z 171.0→子离子m/z 79.0（碰撞能量-25eV）
• 定量限：可达0.1pmol/μL，适用于微量细胞样本

四、数据分析与质量控制

1. 浓度计算： �������=(��������−�������)−��×��Csample​=a(ODsample​−ODblank​)−b​×DF （a、b为标准曲线斜率/截距，DF为稀释因子）

2. 干扰物排除：

   • 内源性甘油：加入甘油激酶抑制剂（氟化钠）或单独测定甘油背景值
   • 磷酸二羟丙酮：通过样本空白（不加GPDH）校正

3. 质控要求：

   • 每批检测含低/中/高浓度质控品（如30μM, 80μM, 150μM G3P）
   • 回收率需在85-115%，批内CV<5%，批间CV<10%

五、方法学比较

六、常见问题解决方案

• 读数不稳定：检查NAD⁺是否失活（需-20℃避光保存），反应温度波动需<±0.5℃
• 回收率偏低：样本处理中G3P降解，需优化淬灭速度或添加蛋白酶抑制剂
• 基质效应（LC-MS）：采用同位素内标（如¹³C₃-G3P）校正离子抑制

注：所有操作需符合实验室安全规范，有机溶剂废液单独收集，酶反应终止液按化学废弃物处理。

本方法通过酶促反应特异性识别G3P，结合严格的样本前处理与质控流程，可准确量化生物样本中代谢通量变化，为代谢机制研究提供可靠数据支撑。实验设计建议包含平行样本与重复检测，确保结果可重现性。