磷酸二羟丙酮含量检测

发布时间：2025-06-25 14:24:03 阅读量：7 作者：生物检测中心

磷酸二羟丙酮含量检测技术详解

一、引言

磷酸二羟丙酮（Dihydroxyacetone phosphate, DHAP）是糖代谢途径（如糖酵解和甘油代谢）中的关键中间代谢产物。它在细胞能量供应、脂质合成以及糖异生等生理过程中扮演着不可或缺的角色。准确测定生物样本（如血液、组织匀浆液、细胞提取物、微生物培养液等）中DHAP的含量，对于深入研究糖代谢调控机制、评估相关代谢酶活性、诊断代谢性疾病（如糖尿病、遗传性代谢缺陷）以及筛选影响代谢通路的化合物等都具有重要意义。

二、检测原理（酶偶联比色法/分光光度法）

目前应用最为广泛且可靠的DHAP检测方法基于特异性酶促反应与分光光度法结合。其核心原理如下：

  1. 特异性酶促反应：

    • DHAP在α-磷酸甘油脱氢酶（α-Glycerophosphate Dehydrogenase, α-GPDH）的催化下，利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作为辅因子，被还原生成α-磷酸甘油（Glycerol-3-phosphate, G3P）。
    • 反应式： DHAP + NADH + H⁺ ⇌ G3P + NAD⁺
    • 此反应高度特异于DHAP，且为可逆反应。在过量NADH存在且反应条件（如pH）控制得当的情况下，反应倾向于向右进行。

  2. 信号检测：

    • 在反应过程中，NADH被氧化生成NAD⁺。
    • NADH在波长340 nm处有特征性吸收峰，而NAD⁺在此波长下几乎不吸收光。
    • 因此，随着反应的进行，反应体系在340 nm处的吸光度值（OD₃₄₀）会持续下降。
    • OD₃₄₀下降的速率（ΔOD₃₄₀/min）或下降的总量（ΔOD₃₄₀）与反应体系中DHAP的浓度成正比。

三、所需主要试剂与材料

  • 缓冲液： 适宜pH的缓冲液（如50-100 mM 三乙醇胺缓冲液，pH 7.5-7.8，含适量Mg²⁺或EDTA，具体根据酶要求优化），用于维持酶活性和反应环境。
  • 辅因子： 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），高纯度。
  • 特异性酶： α-磷酸甘油脱氢酶（α-GPDH），需有足够的活力和特异性。
  • 标准品： 磷酸二羟丙酮（DHAP）标准品（如钠盐或环己胺盐），用于绘制标准曲线。
  • 样品稀释液/去蛋白试剂（可选）： 根据样本类型，可能需要使用适当的稀释液或进行去蛋白处理（如高氯酸沉淀、乙腈沉淀等）以去除干扰物质。去蛋白后需中和上清液。
  • 实验耗材： 紫外/可见光分光光度计（或酶标仪）、石英比色皿（或适用于酶标仪的微孔板）、移液器及枪头、计时器、离心机、冰盒、离心管、反应管/微孔板等。
  • 纯水： 高纯度去离子水或超纯水。

四、操作步骤（示例流程）

  1. 样品制备：

    • 血液/血浆/血清： 采集后尽快分离（如离心），立即检测或-80℃保存。检测前可适当稀释或按需去蛋白（如加入一定体积的冰冷高氯酸，离心取上清，用KOH或K₂CO₃中和至中性）。
    • 组织： 迅速取材，称重，加入适量预冷缓冲液或去蛋白试剂（如高氯酸），冰浴条件下充分匀浆。离心（如4℃，12000×g，10 min），取上清液。若使用去蛋白试剂，需中和上清液。
    • 细胞： 收集细胞，PBS洗涤，重悬于适量缓冲液或去蛋白试剂中，裂解（冻融、超声或加裂解液）。离心取上清，必要时中和。
    • 微生物培养液： 离心收集细胞或直接取上清液，可能需要稀释或去蛋白处理。

  2. 标准曲线制备：

    • 用缓冲液或样品稀释液将DHAP标准品配制成一系列浓度梯度的溶液（如0, 10, 20, 50, 100, 200 μM）。
    • 每个浓度点需设置复孔。

  3. 反应体系建立（以1 ml体系为例，可按比例缩放）：

    • 在石英比色皿（或微孔板孔）中加入：
      • 缓冲液： 约800-900 μl (体积需根据最终定容调整)
      • NADH溶液： 加入适量体积使其在反应体系中达到所需终浓度（通常为0.1-0.2 mM）。混匀。
    • 将比色皿放入分光光度计（或微孔板放入酶标仪）中，预热至反应温度（通常25℃或30℃），在340 nm波长下调零（以空气或水为空白）或读取初始基线（至少1-2分钟，确保稳定）。
    • 启动反应： 迅速加入：
      • 样品/标准品： 50-100 μl (根据预期浓度调整体积，确保OD下降在仪器线性范围内)
      • 立即混匀。
    • 启动酶反应： 迅速加入：
      • α-GPDH酶溶液： 适量体积（根据酶活计算，通常使反应体系达到0.5-2 U/ml）。立即混匀。
    • 同时开始计时。

  4. 吸光度监测：

    • 在340 nm波长下，连续监测吸光度值（OD₃₄₀）的变化至少3-5分钟（或直至反应基本完成，OD下降趋于平缓）。
    • 记录时间点（如每15秒或30秒）对应的OD₃₄₀值。

  5. 数据记录：

    • 记录每个样品和标准品反应启动后的时间-吸光度数据。

五、数据分析与计算

  1. 计算反应速率：

    • 选择反应初期线性下降阶段（通常前1-3分钟），计算单位时间内OD₃₄₀的变化值：ΔOD₃₄₀/min = (OD_start - OD_end) / 时间(min)。
    • 或者，计算从反应开始到结束（或某个固定时间点）的总OD下降值：ΔOD₃₄₀ = OD_initial - OD_final（注意初始OD指加入酶启动反应时的OD）。

  2. 绘制标准曲线：

    • 以标准品DHAP的浓度（μM或mM） 为横坐标（X轴），以其对应的ΔOD₃₄₀/min（速率法）或 ΔOD₃₄₀（终点法） 为纵坐标（Y轴），绘制散点图。
    • 进行线性回归分析，得到标准曲线方程：Y = aX + b（其中Y为吸光度变化，X为DHAP浓度）。

  3. 计算样品浓度：

    • 将测得的样品ΔOD₃₄₀/min（或ΔOD₃₄₀） 代入标准曲线方程（Y值），解出对应的X值，即为样品反应体系中DHAP的浓度（C_sample_reaction, 单位μM或mM）。
    • 计算原始样品中DHAP浓度： 原始样品浓度 = C_sample_reaction × (反应体系总体积 / 加入样品体积) × 稀释倍数
      • 反应体系总体积： 如1 ml。
      • 加入样品体积： 如0.1 ml。
      • 稀释倍数： 若样品经过稀释（如组织匀浆时加入的缓冲液体积/组织重量，或去蛋白后的稀释/浓缩步骤），需乘以相应的稀释因子。对于组织样品，通常表示为 μmol/g wet weight（微摩尔/克湿重）或 nmol/mg protein（纳摩尔/毫克蛋白），后者需另外测定样品蛋白浓度。

六、方法学考量与注意事项

  1. 特异性与干扰：

    • 酶法特异性高，但极高浓度的某些物质（如丙酮酸、草酰乙酸等能与NADH反应的α-酮酸）或内源性脱氢酶可能产生干扰。去蛋白步骤能有效去除大部分干扰酶和大分子。
    • 建议设置样品空白：在反应体系中不加α-GPDH酶，其他步骤相同，测定样品自身在340 nm的背景变化（如内源性NADH氧化或其它干扰物的吸收），必要时从总ΔOD中扣除。

  2. 灵敏度与线性范围：

    • 灵敏度取决于仪器的检测限和反应体系设计。通常可检测低至数μM的DHAP浓度。
    • 确保样品和标准品的吸光度变化（ΔOD₃₄₀）在标准曲线的线性范围内。过高浓度需稀释样品。

  3. 酶活性和稳定性：

    • α-GPDH和NADH对温度、pH敏感。试剂（尤其是酶溶液和NADH溶液）应临用前配制或在冰上保存。避免反复冻融。
    • 确认所用酶的比活力足以在合理时间内完成反应。

  4. 反应条件优化：

    • pH、温度、离子强度（Mg²⁺常作为辅助因子）需严格控制在酶的最适范围内，以保证反应效率和线性。
    • 缓冲液种类和浓度需优化，避免抑制酶活。

  5. 样本处理：

    • DHAP在生物样本中相对不稳定。取样后应迅速处理（如液氮速冻、酸提取去蛋白），并低温保存（-80℃）。避免反复冻融。
    • 去蛋白步骤对组织、细胞样本尤为重要，可防止内源性酶干扰和蛋白沉淀。

  6. 仪器校准：

    • 定期校准分光光度计/酶标仪的波长和光程准确性。

  7. 质量控制：

    • 每次实验均应包含标准曲线和空白对照。
    • 可设置质控样品（如已知浓度的标准品或加标回收样本）监控实验准确性。

七、应用领域

  • 基础代谢研究： 研究糖酵解、甘油代谢、糖异生等途径的通量调控。
  • 酶学分析： 测定醛缩酶（Aldolase）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、磷酸丙糖异构酶（TPI）、甘油激酶（Glycerol Kinase）、α-磷酸甘油脱氢酶（α-GPDH）等酶的活性（常作为偶联反应中的底物或产物）。
  • 临床诊断： 辅助诊断遗传性代谢病（如TPI缺乏症）、糖尿病及其并发症（研究糖代谢异常）。
  • 药物研发与筛选： 评估药物对糖代谢通路的影响。
  • 微生物生理学： 研究微生物的糖利用和能量代谢。
  • 食品与农业科学： 分析发酵过程或农产品中的相关代谢物。

八、安全提示

  • DHAP标准品、高氯酸、乙腈等试剂可能具有刺激性或毒性。操作时需佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜），并在通风橱内处理挥发性或有毒试剂。
  • 严格遵守实验室安全规范处理生物样本（血液、组织等）和废弃试剂。

总结

酶偶联分光光度法因其特异性高、操作相对简便、成本适中，是检测磷酸二羟丙酮（DHAP）含量的金标准方法。通过严格控制实验条件、优化样本处理流程、设置合理的对照并进行严谨的数据分析，可以获得准确可靠的DHAP浓度数据，为广泛的生物医学研究、临床诊断和工业应用提供关键信息。该方法的核心在于利用α-磷酸甘油脱氢酶催化DHAP还原反应伴随的NADH氧化，通过监测340 nm处吸光度的下降来定量DHAP。