磷酸烯醇丙酮酸（PEP）含量检测方法
一、 引言
磷酸烯醇丙酮酸（Phosphoenolpyruvate, PEP）是糖酵解途径和糖异生途径中的关键高能中间代谢物，同时也参与芳香族氨基酸合成、磷酸转移酶系统（PTS）转运等多种重要生理过程。其在细胞内的含量变化直接影响碳流分配、能量代谢平衡及胁迫响应能力。因此，准确测定生物样本（如植物组织、微生物培养物、动物组织匀浆、血清等）中的PEP含量，对于深入研究代谢调控机制、生理状态评估及疾病病理研究具有重要意义。酶联分析法因其特异性强、灵敏度高、操作便捷且无需昂贵仪器，成为实验室测定PEP含量的常用方法。
二、 检测原理
本方法基于PEP在丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）催化下生成丙酮酸（Pyruvate）和腺苷三磷酸（ATP）的可逆反应。通过加入过量的ADP，使反应向生成丙酮酸和ATP的方向进行。随后，利用乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）催化丙酮酸还原为乳酸，同时伴随还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化为NAD⁺。NADH在340 nm波长处具有特征吸收峰，其消耗量与样品中PEP含量成正比。通过监测反应体系在340 nm处吸光度（A₃₄₀）的下降速率或下降值，即可定量计算样本中的PEP含量。
核心反应方程式：
PEP + ADP ⟶ (PK) Pyruvate + ATPPyruvate + NADH + H⁺ ⟶ (LDH) Lactate + NAD⁺
三、 实验材料与试剂
- 样本： 新鲜采集的组织（需快速液氮冷冻保存）或细胞、体液样品（如血清、培养液上清）。
- 提取缓冲液： 推荐使用50-100 mM的Tris-HCl缓冲液（pH 7.4 - 8.0），或50 mM HEPES-KOH缓冲液（pH 7.2 - 7.8），通常含有1-5 mM EDTA（螯合抑制PK活性的金属离子）。使用前预冷至4°C。
- 反应缓冲液（工作液）： 含以下成分的缓冲液（如50 mM Tris-HCl, pH 7.5）：
- ADP：约1.0 - 2.0 mM (过量)
- NADH：约0.15 - 0.20 mM (过量)
- 氯化钾（KCl）：约100 mM (激活PK)
- 氯化镁（MgCl₂）：约10 mM (PK辅因子)
- 酶溶液：
- 丙酮酸激酶（PK）：活性单位需满足实验要求，反应体系中最终浓度通常为2 - 5 U/mL。
- 乳酸脱氢酶（LDH）：活性单位需满足实验要求，反应体系中最终浓度通常为5 - 10 U/mL。临用前用冷的反应缓冲液或无酶水配制。
- 标准品： 磷酸烯醇丙酮酸（PEP）标准品（如Tris盐或环己胺盐）。精确配制一系列浓度的标准溶液（如0, 2.5, 5, 10, 20, 40 µM），溶于与样本提取液基质相似的缓冲液中（如提取缓冲液）。
- 仪器： 紫外-可见分光光度计（带恒温比色皿架）、低温离心机、匀浆器或研磨仪、移液器、计时器、比色杯（光径通常为1 cm）。
四、 实验步骤
(一) 样本制备 (关键步骤，需在冰上操作)
- 称重/定量： 准确称取冷冻组织（或细胞沉淀、定量体积的体液）。
- 匀浆/提取： 加入预冷的提取缓冲液（体积根据样本量调整，如按重量/体积比1:5 - 1:10）。在冰浴条件下，使用合适设备（如研钵、匀浆器、超声波破碎仪）充分研磨或匀浆。
- 除蛋白： 匀浆液在4°C下，以12000 - 15000 × g离心15 - 20分钟。
- 收集上清： 小心吸取上清液（即样品提取液），转移至新的预冷离心管中，置于冰上备用。此即为待测样本液。避免反复冻融，建议尽快测定。
(二) 标准曲线建立
- 分别取不同浓度的PEP标准溶液（如0, 2.5, 5, 10, 20, 40 µM）各一定体积（如50 µL）加入比色杯中。
- 向每个比色杯中加入反应缓冲液（工作液），使总体积接近最终反应体积（如950 µL）。
- 混匀，置分光光度计中恒温（通常25°C或30°C）平衡几分钟。
- 加入适量酶溶液（如包含PK和LDH），迅速混匀启动反应。记录加入酶的时间点（t=0）。
- 立即监测反应体系在340 nm波长处的吸光度（A₃₄₀）变化：
- 动力学法（推荐）： 连续监测A₃₄₀下降速率（ΔA₃₄₀ / min），持续1-3分钟直至线性良好。计算每分钟吸光度的下降值（速率v）。
- 终点法： 准确记录反应启动时（t=0）和反应完全结束（约5-15分钟）时的A₃₄₀值，计算吸光度下降值（ΔA₃₄₀）。
(三) 样本测定
- 取适量样本提取液（体积根据预估PEP浓度而定，如50 µL）加入比色杯。
- 后续步骤（加反应缓冲液、平衡、加酶启动反应、监测A₃₄₀变化）与标准曲线测定完全相同，确保反应条件（温度、体积、酶量、时间）一致。
- 每个样本建议设置复孔。
五、 结果计算
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动力学法：
- 计算各标准品浓度点对应的反应速率 v (ΔA₃₄₀ / min)。
- 以标准品PEP浓度[S] (μM或nmol/mL) 为横坐标（X），反应速率v (ΔA₃₄₀ / min) 为纵坐标（Y），绘制标准曲线（通常为直线）。计算回归方程 Y = aX + b（a为斜率，b为截距）。要求R² > 0.99。
- 计算待测样本的反应速率 v_sample (ΔA₃₄₀ / min)。
- 根据标准曲线回归方程，计算样本反应液中PEP浓度：
[PEP]_reaction = (v_sample - b) / a(单位：μM 或 nmol/mL)。 - 计算原始样本中PEP含量：
PEP 含量 = [PEP]_reaction × (V_total / V_sample) × (V_extract / W)[PEP]_reaction：反应杯中PEP浓度 (μM 或 nmol/mL)V_total：反应体系总体积 (mL)V_sample：加入反应杯中的样本提取液体积 (mL)V_extract：用于提取样本的缓冲液总体积 (mL)W：提取所用原始样本的重量 (g) 或体积 (mL) 或细胞数。- 常用单位： nmol/g FW (鲜重), nmol/mL (血清/上清), pmol/10⁶ cells。
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终点法：
- 计算各标准品浓度点对应的吸光度下降值 ΔA₃₄₀。
- 以标准品PEP浓度[S] (μM或nmol/mL) 为横坐标（X），ΔA₃₄₀ 为纵坐标（Y），绘制标准曲线（通常为直线）。计算回归方程 Y = aX + b。
- 计算待测样本的 ΔA₃₄₀_sample。
- 根据标准曲线回归方程，计算样本反应液中PEP浓度：
[PEP]_reaction = (ΔA₃₄₀_sample - b) / a。 - 按动力学法公式计算原始样本中PEP含量。
六、 注意事项
- 样本处理： 快速冷冻及低温操作至关重要，防止PEP降解或代谢转化。避免反复冻融提取液。
- 酶活性： PK和LDH的活性是实验成功的关键。使用高质量的酶制剂，严格按照推荐条件保存（通常-20°C），临用前配制酶混合液。定期验证酶活性。
- 干扰物质： 样本中存在的丙酮酸、ATP、ADP、NADH、NAD⁺等可能会干扰测定。严格的空白对照（不加酶或加入灭活酶的样本）有助于评估背景干扰。高浓度铵离子可能抑制PK。必要时可对提取液进行脱盐处理。
- 光度计校准： 确保比色杯洁净无痕，光路准确。定期校验分光光度计的波长和吸光度准确性。
- 试剂纯度： 使用高纯度的ADP、NADH和水。NADH溶液不稳定，需避光低温保存，临用前配制或使用新鲜解冻液。
- 反应线性： 确保反应在测定的时间内呈线性（ΔA₃₄₀下降速率恒定）。样本提取液浓度过高可能导致反应超出线性范围，需适当稀释后重测。
- 温度控制： 反应温度必须严格控制恒定，温度波动会影响酶活性和反应速率。
- 基质效应： 标准品溶液的基质（缓冲液成分、pH）应尽量与样品提取液保持一致，以减小基质效应对标准曲线的影响。
七、 应用
本方法广泛应用于：
- 植物生理学： 研究光合作用、呼吸代谢、碳分配、非生物胁迫（干旱、盐、低温）及生物胁迫下能量代谢状态。
- 微生物学： 分析细菌、酵母等微生物的糖代谢途径效率（如糖酵解通量）、PTS转运活性、发酵过程监控。
- 动物与医学研究： 检测肝脏、肌肉等组织中糖异生活性，研究代谢性疾病（如糖尿病）、癌症代谢重编程中PEP水平的改变。
- 酶学研究： 测定PK酶活性或研究PK抑制剂/激活剂效应（需调整实验设计）。
八、 方法特点总结
- 优点： 特异性高（酶促反应）、灵敏度较好（可检测nmol级别）、操作相对简便、成本较低、易于在大多数生化实验室开展。
- 局限性： 易受相关代谢物干扰、对样本处理和酶活性要求严格、反应达到平衡所需时间较长（终点法）、无法同时检测多种代谢物。
通过严格遵守操作规程并注意关键细节，该酶联法可为研究者提供可靠的生物样本中磷酸烯醇丙酮酸含量的定量数据。