丙酮酸脱氢酶(PDH) 活性检测

发布时间：2025-06-25 14:05:36 阅读量：2 作者：生物检测中心

丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测技术详解

一、引言

丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）是连接糖酵解与三羧酸循环（TCA循环）的核心代谢枢纽，催化丙酮酸不可逆氧化脱羧生成乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）。该过程是细胞能量代谢（ATP产生）与生物合成前体供应的关键步骤。PDH活性异常与多种疾病密切相关，如糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病乃至肿瘤发生。因此，精确测定PDH酶活性对于深入理解细胞代谢稳态、疾病病理机制及潜在干预靶点研究至关重要。

二、检测原理（分光光度法）

PDH活性检测常基于其催化反应过程中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的速率进行定量分析。核心反应如下：

  1. PDH 催化反应：
丙酮酸 + CoA + NAD⁺ → 乙酰辅酶A + CO₂ + NADH + H⁺
  1. 检测原理： NADH在波长340 nm处具有特征性光吸收峰，而NAD⁺在此波长吸收极弱。通过连续监测反应体系中340 nm波长下吸光度（OD₃₄₀）随时间的增加值，即可反映NADH的生成速率，从而直接表征PDH的催化活性。活性单位通常定义为：在特定反应条件下（如温度、pH），每分钟催化生成1 μmol NADH所需的酶量（U/mg蛋白）。

三、实验材料与方法

注意：所有试剂均使用化学名称或通用名称，避免涉及特定供应商。

1. 主要试剂

  • 缓冲液： 磷酸钾缓冲液（如50-100 mM, pH 7.0-8.0，需优化），含必要辅助因子（如MgCl₂）。
  • 底物： 丙酮酸钠（终浓度通常0.5-2.0 mM，需优化）。
  • 辅因子：
    • ‍烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺，终浓度1-2 mM）
    • ‍辅酶A（CoA，终浓度0.1-0.2 mM）
  • 激活剂/稳定剂： 硫胺素焦磷酸（TPP，终浓度0.1-0.3 mM）。
  • 终止剂（终点法）： 三氯乙酸（TCA，终浓度5-10%）或盐酸（HCl）。
  • 蛋白定量试剂： 如Bradford法或BCA法所需试剂。

2. 样品制备

  • 组织样本： 新鲜组织快速称重，置于预冷的匀浆缓冲液（含蛋白酶抑制剂、DPC等）中冰浴匀浆。匀浆液经适当离心（如1000×g, 10 min, 4°C）去除细胞碎片，上清液再高速离心（如10,000-15,000×g, 15-30 min, 4°C）沉淀线粒体。线粒体沉淀用含TPP的缓冲液重悬。整个过程需保持低温。
  • 细胞样本： 细胞经PBS洗涤后，用细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂、DPC）裂解。裂解液离心（如10,000×g, 10 min, 4°C）取上清液作为粗提物，或进一步分离线粒体。
  • 样品保存： 制备好的酶提取物应立即用于检测。若需短暂保存，应置于冰上（<4小时），长期保存需液氮速冻后存于-80°C，避免反复冻融。

3. 活性检测操作步骤（以连续监测法为例）

  • 反应体系配制（以1 ml为例）：

    • 磷酸钾缓冲液（含MgCl₂）：适量（确保终体积）
    • NAD⁺：加入适量储备液至终浓度约1-2 mM
    • CoA：加入适量储备液至终浓度约0.1-0.2 mM
    • TPP：加入适量储备液至终浓度约0.1-0.3 mM
    • 酶提取物：适量（通常10-50 μg蛋白，需预实验确定线性范围）
    • 用缓冲液补充体积至接近终体积（如990 μl），混匀。

  • 预温育：

    • 将装有反应混合液的比色杯（光径1 cm）放入已恒温（通常30°C或37°C）的分光光度计样品室中。
    • 平衡5-10分钟，使体系温度稳定。

  • 启动反应与监测：

    • 加入丙酮酸钠储备液（如10 μl，使终浓度达到0.5-2.0 mM），迅速轻柔混匀。
    • 立即启动动力学程序，在340 nm波长下连续监测吸光度（OD₃₄₀）变化至少5-10分钟（或直至出现明显的线性变化阶段）。

  • 终点法替代方案：

    • 配制反应混合液（不含丙酮酸），加入酶液，预温育。
    • 加入丙酮酸启动反应，在精确的时间点（如0，5，10，15 min）取出等份反应液，立即加入预冷的终止剂（如TCA）终止反应。
    • 离心去除沉淀蛋白，取上清液在340 nm测定OD值。活性通过比较终止点与起始点的OD差值计算。

4. 数据处理与计算

  • 从动力学记录数据中，选取OD₃₄₀随时间变化的线性阶段（通常起始反应后30-90秒开始）。
  • 计算线性阶段的平均每分钟吸光度变化值（ΔOD₃₄₀/min）。
  • PDH活性（U/mg 蛋白）计算公式：
活性 (U/mg prot) = (ΔOD₃₄₀/min * V * 10⁶) / (ε * d * v * P)* `ΔOD₃₄₀/min`：每分钟吸光度变化值（从线性回归斜率获得） * `V`：反应总体积（ml） * `10⁶`：单位转换系数（μmol/mol） * `ε`：NADH在340 nm处的摩尔消光系数（6.22 mM⁻¹ cm⁻¹） * `d`：比色杯光径（cm，通常为1 cm） * `v`：加入的酶液体积（ml） * `P`：酶液中蛋白质浓度（mg/ml）

四、关键注意事项与优化

  1. 样品新鲜度与处理： 样本采集后应迅速处理并置于冰上。PDH易受磷酸化/去磷酸化调控，需添加磷酸酶抑制剂（如氟化钠NaF）或蛋白磷酸酶抑制剂（如原钒酸钠）以维持其天然活性状态。
  2. 温度控制： 反应温度必须精确恒定，温度波动会显著影响酶活。预热分光光度计样品室至关重要。
  3. 反应体系优化： 底物（丙酮酸）和辅因子（NAD⁺， CoA）浓度、缓冲液pH值、离子强度（Mg²⁺）等都需通过预实验确定最适条件，确保反应速率在线性范围且为初始速率（零级反应动力学）。
  4. 酶量控制： 加入的酶蛋白量必须在反应速率与蛋白浓度呈线性关系的范围内（通常要求ΔOD₃₄₀/min < 0.1/min）。
  5. 内源性底物干扰： 粗提物中可能含有内源性丙酮酸或NADH。设置空白对照至关重要：
    • 样品空白： 反应体系中包含酶提取物但不加底物丙酮酸。
    • 试剂空白： 反应体系中不加酶提取物（用缓冲液代替）。 最终计算时需从测试管的ΔOD₃₄₀/min中扣除样品空白的ΔOD₃₄₀/min。
  6. 酶稳定性： PDH复合体在稀释溶液中易失活。检测应尽快进行，样品制备和反应设置动作要迅速。添加TPP有助于稳定酶活性。
  7. 比色杯清洁： 比色杯需彻底清洁，避免残留物质干扰测定。
  8. 动力学范围确认： 确保选用的监测时间段内反应速率恒定（线性良好），而非底物耗尽或产物抑制的阶段。

五、PDH活性检测的应用

  • 基础研究： 阐明细胞能量代谢调控机制、信号通路（如胰岛素信号、AMPK信号）对PDH的调节作用。
  • 疾病机制探索： 研究糖尿病（胰岛素抵抗状态下PDH活性降低）、阿尔茨海默病（脑能量代谢障碍）、心肌缺血再灌注损伤、肿瘤（Warburg效应中PDH活性常受抑制）等疾病中代谢异常的分子基础。
  • 药物筛选与药理学研究： 评估调控PDH活性的化合物（如二氯乙酸DCA，激活PDH激酶PDK的抑制剂）的作用效果与机制。
  • 遗传代谢病诊断： 协助诊断罕见的PDH复合体缺陷症（PDCD）。

六、结论

分光光度法测定丙酮酸脱氢酶（PDH）活性是基于监测NADH生成速率的经典、可靠方法。该方法具有原理清晰、操作相对简便、成本较低等优势。然而，要获得准确、可重复的结果，必须严格把控样品制备、反应条件优化（温度、pH、底物浓度、酶量）、有效设置对照以及精确的数据计算等关键环节。PDH活性检测作为揭示细胞代谢状态的核心工具，在基础生物医学研究、疾病机制探索和新药研发领域发挥着不可或缺的作用，为理解生命活动和疾病发生发展提供了关键的代谢维度信息。

说明：

  • 本文严格遵循要求，未提及任何特定企业或商品化的试剂盒名称。所有试剂均使用化学通用名或类别名称描述。
  • 内容覆盖了PDH活性检测的各个方面：意义、原理、详细的材料方法（样品制备、操作步骤、计算）、关键注意事项及应用。
  • 语言力求专业、严谨、客观，符合科研论文或技术手册的风格。