血小板粘附试验 - 中析研究所生物检测中心

血小板粘附试验：原理、方法与临床意义

血小板粘附是止血过程的第一步关键环节，指血小板在血管损伤部位识别并附着于暴露的血管内皮细胞下基质成分（如胶原、微纤维、血管性血友病因子）的能力。血小板粘附试验（Platelet Adhesion Test） 是体外评估血小板此项初始功能的重要手段，对于诊断某些出血性疾病及研究血小板生理病理机制具有重要价值。

一、基本原理

血小板粘附功能的实现依赖于：

血小板膜糖蛋白（GP）受体： 主要是 GP Ib-IX-V复合物（主要受体，结合vWF）和 GP Ia/IIa（整合素α2β1）（结合胶原）。GP Ib-IX-V复合物在血小板高速血流下锚定于vWF至关重要。
血浆粘附蛋白： 最重要的是 血管性血友病因子。其在血管损伤处暴露的胶原上发生构象变化，成为GP Ib-IX-V的高亲和力配体。胶原本身也是血小板GP Ia/IIa和GP VI的直接配体。
血流剪切应力： 血流动力学环境（尤其是高剪切应力）极大地影响血小板与vWF的相互作用，促使粘附发生。

试验模拟体内环境，使抗凝全血或富含血小板血浆（PRP）流经一个带有粘附激活表面（如胶原、玻珠、玻璃等）的装置，然后测定接触前后样本中血小板的数量变化或直接观察粘附情况，以此评估血小板的粘附能力。

二、常用试验方法

目前主要有以下几种技术：

玻珠柱法（Glass Bead Column Method / Salzman Method）：
- 原理： 将抗凝全血在恒定流速下通过一个填充细小玻璃珠的柱子。玻璃珠表面模拟血管损伤部位，血小板会粘附于珠子上。
- 操作： 记录血液通过柱子的时间（通常以秒计），或分别计数流经柱前（原始血样）和柱后血液中的血小板数量。
- 结果计算：
  - 粘附率（%） = [(粘附前血小板计数 - 粘附后血小板计数) / 粘附前血小板计数] × 100%
  - 通过时间（秒）： 时间延长通常提示血小板粘附功能增强（血栓风险），但标准化困难，灵敏度有限。
- 优缺点： 较经典，操作相对简单。但影响因素多（玻珠性状、装填密度、温度、流速、红细胞压积等），标准化困难，重复性欠佳，结果波动较大。
旋转玻瓶法（Rotating Bottle Method / Bounamoux Method）：
- 原理： 将一定体积的抗凝全血注入一个特定的球形玻璃瓶（内壁光滑或经特殊处理）中。将瓶子固定在旋转装置上，以恒定的低速（如3转/分）旋转一定时间（如30分钟）。
- 操作： 分别在旋转前后取血样计数血小板。
- 结果计算：
  - 粘附率（%） = [(旋转前血小板计数 - 旋转后血小板计数) / 旋转前血小板计数] × 100%
- 优缺点： 操作也相对简单，仪器要求不高。但其模拟的是低剪切环境，与体内高剪切状态差异较大，且结果同样受多种因素（瓶壁性质、旋转速度、时间、温度）影响，临床应用受限。
玻片法（Glass Slide Adhesion / Retention Test)：
- 原理： 将一滴抗凝全血滴在洁净的载玻片上，置于湿润环境中（如培养皿内放湿纱布），37℃孵育一定时间（如20-30分钟）。
- 操作： 孵育后，用生理盐水或缓冲液轻轻冲洗玻片，洗掉未粘附的血小板、红细胞和血浆蛋白。固定染色后显微镜下观察计数粘附的血小板。
- 结果： 可通过计数单位面积内粘附的血小板数量或进行半定量评估（如根据粘附密度分级）。
- 优缺点： 操作简单，成本低，可直接观察粘附形态。但主观性较强，定量困难，标准化程度低，主要用于教学或初步筛查。
平行板流动腔法（Parallel Plate Flow Chamber）：
- 原理： 这是目前最接近生理血流环境的粘附研究方法。装置由两块平行板构成，底部板涂覆特定的粘附蛋白（胶原、纤维蛋白原）。抗凝全血或PRP在可控的剪切应力下流过腔室。
- 操作： 通常结合高速显微摄像技术，实时观察、记录和定量分析血小板在流动状态下粘附、铺展、聚集的动力学过程。
- 结果： 可定量分析单位面积粘附血小板数量、粘附速率、铺展面积、血栓体积等参数。
- 优缺点： 能模拟生理/病理剪切力，提供最接近体内环境的粘附信息，结果客观准确。但设备昂贵、操作复杂、技术要求高，主要在科研实验室使用。
基于特定受体的粘附分析：
- 原理： 利用包被有特异性配体（如vWF、胶原、纤维蛋白原）的微孔板或生物传感器。
- 操作： 将洗涤血小板悬液加入孔中，孵育后洗去未粘附血小板。通过检测粘附血小板的酶活性（如加入底物显色）、荧光标记或物理信号（如石英晶体微天平QCM-D、表面等离子共振SPR）变化来定量粘附程度。
- 优缺点： 能研究特定受体-配体介导的粘附，灵敏度高，可实现定量和高通量。但需要洗涤血小板（可能改变其活化状态），且脱离了全血环境和血流剪切力。

三、标准化与影响因素

血小板粘附试验结果的准确性与可重复性受到多种因素影响，需严格标准化：

样本采集： 使用标准枸橼酸钠抗凝管（109 mmol/L, 3.2%），避免穿刺不畅导致血小板活化。采血后充分混匀但避免剧烈震荡。尽快检测（通常2小时内）。
抗凝剂： 枸橼酸钠是首选，EDTA会螯合钙离子破坏GP IIb/IIIa，肝素影响凝血酶活性且可能诱导血小板聚集。
样本类型： 玻珠柱法和旋转瓶法通常用抗凝全血。玻片法可用全血或PRP。平行板腔法和微孔板法多用PRP或洗涤血小板。
血小板计数： 结果计算依赖于准确的计数，需使用标准方法和校准的血细胞分析仪。
温度： 除特定步骤外（如玻片孵育在37℃），操作通常在室温（22-25℃）进行。
流速/剪切力： 对于玻珠柱法、平行板腔法，流速或剪切应力的控制至关重要。
粘附表面材质与处理： 玻珠或玻璃表面的清洁度、粗糙度、是否包被蛋白等直接影响粘附结果。
红细胞压积（Hct）： 全血法中，Hct影响血粘度，进而影响剪切力和血小板在边缘层的分布。
药物： 阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板药物，抗生素（如β-内酰胺类），非甾体抗炎药等可能影响结果，需详细询问病史。
生理状态： 应激、运动、吸烟、饮食（如高脂）等也可能短暂影响血小板功能。

四、临床意义

粘附功能减低：
- 遗传性疾病：
  - 巨大血小板综合征（Bernard-Soulier Syndrome, BSS）： 经典粘附缺陷病。由于GP Ib-IX-V复合物基因缺陷（常为常染色体隐性遗传），导致血小板无法通过vWF粘附到受损血管壁。表现为重度出血倾向（皮肤黏膜出血、月经过多、手术后出血）、巨大血小板、玻珠柱法/旋转瓶法粘附率显著降低。
  - 血管性血友病（von Willebrand Disease, vWD）： 血浆vWF数量减少或质量异常（分3型），导致血小板通过vWF介导的粘附缺陷。粘附率降低程度与vWD严重程度相关。
- 获得性疾病：
  - 骨髓增殖性肿瘤（MPN）： 如原发性血小板增多症（ET），部分患者可因获得性vWD（高剪切力下超大vWF多聚体被ADAMTS13过度降解）或血小板功能异常导致粘附减低。
  - 尿毒症： 多种毒素积累影响血小板功能，包括粘附减弱。
  - 严重肝病： 合成vWF、纤维蛋白原等功能蛋白减少。
  - 体外循环： 血小板与异物表面接触活化并被消耗，功能下降。
  - 抗血小板药物: 如阿司匹林（主要影响聚集）对粘附影响较小，但某些药物可能影响。
  - 弥散性血管内凝血： 血小板消耗过多。
粘附功能增高：
- 血栓前状态/血栓性疾病： 如急性冠脉综合征、缺血性脑卒中、糖尿病、高血压、高脂血症、吸烟、妊娠期等。这些状态下血小板活化程度增加，对粘附表面的反应性增强。但传统玻珠柱法等方法对此检测敏感性有限。平行板腔法或针对特定受体（如GP Ib-IX-V）活化状态的研究更有优势。
- 炎症状态： 炎症因子可激活血小板。

五、结果解读注意事项

试验方法的局限性： 务必明确所用方法及其局限性（如玻珠柱法标准化差、玻片法主观性强）。不能简单比较不同方法的结果。
联合试验的重要性： 血小板粘附试验通常不能单独用于诊断。需结合以下信息综合判断：
- 出血病史： 详细的出血症状、家族史至关重要。
- 血小板计数与形态学： BSS有巨大血小板；vWD血小板计数形态通常正常。
- 其他血小板功能试验： 聚集试验（对多种诱导剂的反应）、释放试验、vWF相关检测（vWF抗原、活性、多聚体分析）、凝血功能检查（筛查凝血因子缺乏）。
- 排除继发性因素： 药物史、系统性疾病等。
临界值： 结果需与实验室建立的参考区间（通常来源于健康志愿者）比较。临界值附近的结果解释需谨慎。
重复性： 必要时重复检测以确认结果。

六、总结

血小板粘附试验是评估止血初始环节的重要工具。尽管传统方法（如玻珠柱法、旋转瓶法）因其标准化困难等因素在临床常规检测中的应用正在减少（被更特异的vWF检测替代），但在诊断BSS时仍有价值，且玻片法在教学和初步筛查中仍有应用。平行板流动腔法等先进技术则在血小板粘附动力学基础研究和特定血栓性疾病机制探讨中发挥着不可替代的作用。理解不同方法的原理、优缺点、标准化要求以及结果的临床意义，对于准确解读和应用该试验至关重要。结合患者临床表现、其他实验室检查（特别是vWD相关检测和血小板聚集试验）进行综合判断，才能为出血或血栓性疾病的诊疗提供有效依据。

注：本文旨在提供血小板粘附试验的医学知识概述，实际检测操作和结果解读应严格遵循所在医疗机构的规程，并由专业医务人员执行。