鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

发布时间：2025-06-25 09:19:32 阅读量：2 作者：生物检测中心

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）：原理、方法与意义

一、 引言 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，通常称为Ames试验（以其主要开发者Bruce Ames教授命名），是现代遗传毒理学领域应用最广泛、认可度最高的短期致突变性筛选试验之一。该试验通过检测化学物质诱导特定组氨酸营养缺陷型沙门氏菌菌株发生回复突变（恢复合成组氨酸能力）的能力，高效预测物质的潜在遗传毒性和致癌性风险，在化学品安全性评价、药品研发、环境污染物监测及食品安全保障等方面发挥着不可或缺的作用。

二、 试验原理 试验的核心基于一组经过精妙遗传改造的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）测试菌株。这些菌株的关键特征是：

  1. 组氨酸营养缺陷型（his⁻）： 菌株在组氨酸合成途径的关键基因上携带特定的点突变（如hisG46, hisD3052, hisC3076等）。这使得它们在缺乏外源性组氨酸的基本培养基上无法生长形成菌落。
  2. 增强的敏感性改造：
    • 脂多糖屏障缺陷（rfa突变）： 细胞壁外膜脂多糖层不完整，增加待测物（特别是大分子）渗透性。
    • DNA切除修复系统缺失（ΔuvrB）： 降低DNA损伤修复能力，提高对致突变剂的敏感性。
    • 质粒pKM101（部分菌株）： 携带表达错误倾向修复（SOS修复）系统的质粒，进一步增强对某些致突变物的敏感性（如TA98, TA100）。
    • 质粒pAQ1（部分菌株）： 增强对某些醛类诱变剂的敏感性（如TA104）。

当具有致突变活性的化学物质作用于这些菌株时，可能通过碱基置换或移码突变等方式，使其组氨酸合成基因上的突变位点再次发生突变（回复突变），恢复合成组氨酸的能力（his⁺）。回复突变菌能在不含组氨酸的基本培养基上生长并形成肉眼可见的菌落。通过计数回复突变菌落数相对于自发回复突变数（本底）的增加量，即可评价该化学物质的致突变潜力。

三、 核心要素

  1. 标准测试菌株： 常用菌株组合通常包括：
    • TA98：检测移码型突变（hisD3052）。
    • TA100：检测碱基置换型突变（hisG46）。
    • TA1535：检测碱基置换型突变（hisG46），无pKM101。
    • TA1537 / TA97 / TA97a：检测特定类型的移码突变（hisC3076）。
    • TA102：检测广泛的点突变（hisG428）及氧化损伤，具有完整的脂多糖屏障和pKM101、pAQ1质粒，对醛类、交联剂、过氧化物等敏感。
    • （注：菌株选择需根据测试目的和指南要求，通常至少包含4-5株，覆盖不同突变类型）。
  2. 代谢活化系统（S9 Mix）：
    • 目的： 模拟哺乳动物体内的肝脏代谢，将前致突变物/前致癌物（本身无遗传毒性，需代谢活化）转化为具有遗传毒性的活性代谢物。
    • 成分： 由经多氯联苯（如Aroclor 1254）或苯巴比妥/β-萘黄酮联合诱导的大鼠（或其他物种）肝脏制备的肝微粒体组分（S9 Fraction），辅以必需的辅因子（NADPH再生系统、葡萄糖-6-磷酸、MgCl₂、KCl等）和缓冲液。
    • 应用： 试验需在**有代谢活化（+S9）和无代谢活化（-S9）**两种条件下平行进行。
  3. 试验方法（平板掺入法）：
    1. 菌株准备： 使用经基因型确认和自发突变率验证的新鲜过夜培养物。
    2. 顶层琼脂制备： 融化并保温（约45°C）顶层琼脂（含低浓度组氨酸/生物素）。
    3. 反应体系混合： 在无菌试管中依次加入：
      • 一定体积的测试菌液（通常10⁸细胞/皿）。
      • 待测试样品溶液（溶解于适当溶剂如DMSO、水、乙醇等，设置多个剂量组）。
      • 活化系统（S9 Mix，+S9组）或缓冲液（-S9组）。
      • 顶层琼脂（迅速混匀）。
    4. 倾注平板： 立即将混合物倾倒在最低葡萄糖基本琼脂平板上，旋转平板使其均匀分布。
    5. 孵育： 平板在避光条件下，37°C倒置培养48-72小时。
    6. 菌落计数： 人工或自动化计数每皿上的回复突变菌落（his⁺ revertant colonies）。
  4. 对照设置：
    • 溶剂对照： 仅含测试菌、溶剂（与样品所用相同体积）和顶层琼脂，测定自发回复突变本底值。
    • 阳性对照：
      • -S9组： 如TA1535/TA100常用叠氮钠（NaN₃），TA98/TA1537常用9-氨基吖啶（9-AA）或ICR-191。
      • +S9组： 常用2-氨基蒽（2-AA）或环磷酰胺（CP）。
    • 背景菌苔观察： 顶层琼脂中含微量组氨酸，允许所有测试菌进行有限的几轮分裂（形成微弱背景菌苔），这对试验有效性至关重要。

四、 结果分析与判定

  1. 剂量-反应关系： 回复突变菌落数应随测试剂量增加而呈现有统计学意义的升高趋势（剂量相关效应）。
  2. 阳性的判定标准（普遍接受原则）：
    • 在任何一个测试剂量下，回复突变菌落数是溶剂对照（自发回变）的 2倍或以上（≥2倍）。
    • 观察到的回复突变菌落数增加具有剂量依赖性。
    • 至少在一个测试浓度点（不一定是最高浓度），菌落数增加达到统计学显著差异（p<0.05）。
    • 在重复试验中结果具有重现性。
    • （注：具体判定标准可能因不同实验室SOP或监管指南略有差异，但2倍原则是核心）。
  3. 结论：
    • 阳性结果： 表明该试验物质在该试验条件下对所用沙门氏菌菌株具有致突变性。
    • 阴性结果： 表明在该试验条件下，未检测到该物质对所用菌株的致突变活性。
  4. 有效性判据：
    • 溶剂对照的自发回变菌落数应在该菌株的历史本底范围内（良好实验室规范要求）。
    • 阳性对照必须表现出预期的显著菌落数增加。
    • -S9组的背景菌苔应正常（微弱均匀）；+S9组背景菌苔可能稍弱。
    • 无明显污染或测试物导致的毒性抑制（表现为背景菌苔稀疏或缺失，高剂量组回复突变菌落数减少）。

五、 应用与意义

  1. 遗传毒性筛选的金标准： 作为快速、经济、可靠的初筛手段，广泛应用于新化合物（药物、农药、食品添加剂、工业化学品等）的早期筛选和安全性评价。
  2. 致癌性预测： Ames试验阳性物质被高度怀疑具有潜在致癌风险（尽管并非所有诱变剂都是致癌物，反之亦然，但相关性很高），是致癌性测试的重要预筛依据。
  3. 环境监测： 用于评估空气颗粒物、水体、土壤、工业废弃物等环境样本中的遗传毒性污染物。
  4. 作用机制研究： 结合不同菌株的特异性，可初步推断诱变剂的作用机制（如碱基置换型或移码型）。
  5. 监管要求： 被全球主要监管机构（如ICH, OECD, EPA, FDA等）纳入化学品、药品、医疗器械等的遗传毒性测试标准组合（核心电池试验之一，如OECD TG 471）。

六、 局限性与注意事项

  1. 原核生物系统： 测试体系基于细菌，与哺乳动物细胞在遗传物质结构（染色体 vs 细菌DNA）、代谢、DNA修复等方面存在差异，存在假阴性和假阳性的可能。
  2. 特定突变位点： 仅检测特定组氨酸位点的回复突变，可能漏检作用位点在组氨酸基因外的诱变剂或主要引起缺失、重排等大范围改变的遗传毒物。
  3. 代谢活化局限性： S9 Mix模拟的主要是肝脏I相代谢（氧化还原水解），对II相结合代谢模拟不足，且无法模拟器官特异性代谢或肠道菌群代谢。
  4. 假阳性风险： 某些非遗传毒性物质（如高浓度盐、极端pH物质、具有杀菌活性的物质）可能通过细胞毒性等间接机制干扰试验结果。
  5. 假阴性风险： 某些物质可能无法有效渗透入菌体、在细菌体内被迅速失活、或其主要作用于哺乳动物特有的靶点。
  6. 试验设计关键： 选择合适的剂量范围（覆盖从无观察到产生明显毒性的水平）、适当的溶剂和浓度、规范的菌株维护与验证、合格的S9制备和试验操作是获取可靠结果的基础。

七、 结论 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）凭借其原理清晰、操作相对简便、成本低、通量高以及与致癌性良好的相关性，已成为全球公认的遗传毒性风险评估的基石。尽管存在一定的局限性，但其在化学品安全性评价体系中的核心地位无可替代。规范严谨地执行该试验，结合其他体外和体内遗传毒性终点测试，能够为保护人类健康和环境安全提供关键的科学依据。对于任何检测出Ames阳性的物质，都需要进行更深入的研究以评估其对人体的潜在风险。