鼠伤忘沙门氏菌/回复交变试验

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）完整指南

摘要： 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）是国际上广泛采用的遗传毒性初筛方法，通过检测化学物质诱导沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株（his⁻）回复为原养型（his⁺）的能力，评估其致突变潜力。本文详细阐述其原理、标准操作流程（包括菌株选择、代谢活化系统应用、实验设计）、结果判定标准及应用范围，为化学品及环境样品遗传毒理学评估提供关键技术支持。

1. 背景与原理

• 理论基础： 基于DNA损伤修复原理。试验使用一组经特定基因改造的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）测试菌株。这些菌株在编码组氨酸合成关键酶的基因（his基因）上携带移码或碱基置换突变，使其丧失在缺乏组氨酸的培养基上生长的能力（his⁻ 表型）。
• 回复突变： 当受试物（直接诱变剂或其代谢活化产物）作用于细菌DNA，若在his基因或其调控区域诱发特定的回复突变（移码或碱基置换），即可恢复组氨酸合成能力，使细菌能够在无组氨酸的培养基上形成肉眼可见的菌落。
• 代谢活化系统（S9 Mix）： 为模拟哺乳动物体内的代谢过程，试验常加入经酶诱导剂（如多氯联苯）处理的啮齿类（大鼠或仓鼠）肝脏匀浆后制备的S9组分与辅助因子的混合物（S9 Mix）。该系统可将许多本身无诱变性但在体内代谢活化后具有诱变活性的前诱变剂转变为终诱变剂。

2. 材料与方法

2.1 主要试剂与材料

• 测试菌株： 一组标准组氨酸缺陷型（his⁻）鼠伤寒沙门氏菌菌株，通常包括：
  • TA98：检测移码诱变剂（hisD3052，含R因子pKM101增强DNA损伤易错修复）。
  • TA100：检测碱基置换诱变剂（hisG46，含pKM101）。
  • TA1535：检测碱基置换诱变剂（hisG46，无pKM101）。
  • TA1537：检测移码诱变剂（hisC3076，无pKM101）。
  • TA102：检测多种诱变剂（hisG428，染色体突变，含pKM101和pAQ1质粒，对醛类、过氧化物、交联剂敏感）。
  • (其他补充菌株如TA97, TA104等视需求选用)。
• 培养基：
  • 营养肉汤/琼脂： 用于菌株增殖与保存。
  • 最低葡萄糖琼脂（Vogel-Bonner Medium E）： 用作底层基本培养基。
  • 顶层琼脂（Top Agar）： 含低浓度组氨酸和生物素（通常0.5 mM组氨酸/0.05 mM生物素），用于混合菌液、受试物/S9 Mix并铺于底层培养基上。
• 代谢活化系统：
  • S9组分： 来源于经酶诱导处理的啮齿类肝脏匀浆上清液。
  • S9 Mix： S9组分与辅因子（NADP、葡萄糖-6-磷酸、盐溶液）的混合液。临用前配制。常用浓度为5-30% (v/v)，通常10%。
• 阳性对照物： 选择已知对特定菌株敏感的强诱变剂。例如：
  • 不加S9：TA98/TA1537用2-氨基芴(2-AA)或4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)；TA100/TA1535用叠氮化钠(NaN₃)；TA102用丝裂霉素C(MMC)或1,8-二羟基蒽醌(Danthron)。
  • 加S9：TA98/TA100/TA1535用2-氨基蒽(2-AA)或苯并[a]芘(BaP)。
• 阴性对照（溶剂对照）： 溶解受试物所用的溶剂（如蒸馏水、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇等），其浓度与受试物所用最高溶剂浓度一致。
• 受试物： 待测化学物质或混合物。需溶解于适当的无毒溶剂中。
• 无菌器具： 培养皿、试管、移液器及枪头、水浴锅、恒温培养箱（37°C）、漩涡混合器、生物安全柜等。

2.2 标准操作流程（以平板掺入法为例）

1. 菌株准备与鉴定：

   • 从冻存管或主平板活化标准菌株。
   • 增殖：挑单菌落接种于营养肉汤，37°C振荡培养约10-16小时至对数生长后期（菌液浓度约1-2 × 10⁹ CFU/mL）。
   • 菌株特性鉴定（定期进行）：确认组氨酸需求（his⁻）、深粗糙型（rfa）突变（对结晶紫等大分子敏感）、紫外线修复缺陷（uvrB⁻，删除或突变）、R因子（pKM101和/或pAQ1）存在及其抗性（如氨苄青霉素抗性）、自发回变数等符合要求。
   • 菌液浓度调整：用生理盐水或磷酸盐缓冲液稀释新鲜培养物至合适浓度（通常约10⁸ CFU/mL）。

2. 受试物剂量设置：

   • 设置多个剂量组。最高剂量应达到溶解度极限或出现明显细胞毒性（背景菌苔变薄或消失），但不应完全抑制背景菌苔生长。通常至少设5个几何级数递减的剂量（如5000, 1500, 500, 150, 50 µg/plate）。
   • 同时设阴性（溶剂）对照组和阳性对照组（加与不加S9）。

3. 试验平板制备（平板掺入法）：

   • 融化顶层琼脂（含低浓度组氨酸/生物素），保温于45°C水浴。
   • 加样混合（无菌操作）： 在无菌试管中依次加入：
     • 0.1 mL稀释菌液。
     • 0.1 mL受试物溶液（或0.1 mL溶剂作阴性对照，或0.1 mL阳性对照物）。
     • （需要代谢活化时）0.5 mL S9 Mix；或（无需代谢活化时）0.5 mL 缓冲液/盐溶液（如磷酸盐缓冲液）。
   • 立即加入2.0 mL融化的顶层琼脂（45°C），迅速混匀（可轻微涡旋）。
   • 迅速倾倒于预置的、已凝固的最低葡萄糖琼脂平板上，轻轻旋转平板使顶层均匀覆盖。
   • 待顶层琼脂完全凝固。
   • 每个剂量组、每个活化条件（±S9）、每个菌株至少做3个平行平板。

4. 培养：

   • 将平板倒置于37°C恒温培养箱中避光培养。
   • 培养时间通常为48-72小时（通常48小时观察计数）。

5. 观察与计数：

   • 培养结束后，取出平板计数。
   • 肉眼或菌落计数器计数每块平板上生长的回复突变菌落（his⁺菌落）。这些菌落通常较大，生长在背景菌苔（由低浓度组氨酸支持有限生长形成的微弱菌膜）之上。
   • 记录每个平板上的回变菌落数。

3. 结果判定与标准

1. 有效性判定（试验成立条件）：

   • 阴性对照： 各菌株的自发回变菌落数应在该菌株的历史自发回变数范围内（通常有实验室特定范围，如TA98: 20-50; TA100: 75-200; TA1535: 5-20; TA1537: 5-20; TA102: 240-360）。
   • 阳性对照： 加与不加S9的阳性对照组的回变菌落数必须显著高于其对应的自发回变数（通常至少2倍以上），否则试验无效。
   • 背景菌苔： 所有平板（包括最高剂量组）均应观察到背景菌苔（表明组氨酸耗尽前细菌有过生长），否则该剂量数据不可靠。菌苔明显变薄或消失提示细胞毒性。

2. 受试物结果判定：

   • 剂量-反应关系： 回变菌落数随受试物剂量增加而增加。
   • 统计学显著性： 某一剂量组的平均回变菌落数（至少3个平行平板）是同期阴性对照组平均自发回变菌落数的2倍或以上（即回复突变率 ≥ 2），且这种增加具有统计学意义（如采用如双尾t检验、方差分析加Dunnett’s检验等方法，p < 0.05）。
   • 重现性： 在重复试验中（通常要求至少两次独立试验），结果一致。
   • 菌株特异性： 在多个菌株上获得阳性结果更具说服力。
   • 细胞毒性评估： 观察背景菌苔是否变薄或消失。若最高剂量组因细胞毒性导致菌落数下降，不应视为阴性结果，应关注较低剂量下的升高趋势。

3. 结论：

   • 阳性结果： 满足以下任一条件：
     • 在至少一个菌株上（加或不加S9），一个或多个剂量组出现有统计学意义的剂量相关性回复突变菌落数增加（≥2倍自发回变数）。
     • 在不止一个菌株上出现可重复的阳性反应。
   • 阴性结果： 在所有测试菌株上（加或不加S9），所有剂量组均未出现有统计学意义的、达到2倍以上且可重复的回复突变菌落数增加。
   • 不确定结果： 结果模棱两可（如仅在极高毒性剂量下略有增加，或重现性差），需重复试验或补充试验确认。

4. 应用范围与意义

• 主要用途：
  • 化学物质安全性评估： 新化学品（药物、农药、食品添加剂、化妆品原料、工业化学品等）遗传毒性初筛的首选方法。
  • 环境污染物监测： 检测水体、土壤、空气颗粒物、工业废弃物等复杂混合物中的遗传毒性物质。
  • 药物杂质评价： 评估药物中遗传毒性杂质的风险。
  • 机制研究： 初步判断诱变剂类型（移码或碱基置换）及是否需要代谢活化。
• 优势：
  • 快速、经济、高通量。
  • 操作相对标准化（遵循OECD 471, ISO 16240, ICH S2(R1)等国际指南）。
  • 能检测多种遗传损伤终点（点突变、小的插入/缺失）。
  • 引入S9 Mix可有效检测前诱变剂。
  • 数据库庞大，结果可比性强。
• 局限性：
  • 检测对象是原核生物，不完全等同于哺乳动物细胞。
  • 主要检测基因点突变，对染色体畸变、非整倍体等其它类型DNA损伤不敏感。
  • 某些类别的诱变剂检测效率不高（如部分金属、高分子化合物）。
  • 复杂混合物可能产生干扰。
  • 假阳性和假阴性结果均可能存在，需结合其它遗传毒性试验综合判断。

5. 质量控制与注意事项

• 菌株保藏与维护： 严格无菌操作，定期传代并确认关键特性（组氨酸需求、深粗糙型、uvrB缺失、R因子及抗性、自发回变数）。
• S9活性验证： 使用标准前诱变剂（如2-AA）定期验证S9 Mix的代谢活化能力。
• 无菌操作： 试验全过程防止杂菌污染。
• 受试物处理： 确保受试物完全溶解且均匀，注意溶剂对菌株的潜在毒性。
• 试验重复： 阳性结果必须经独立重复试验确认。
• 标准化操作： 严格遵循实验室标准操作规程（SOP）及国际指南。
• 数据记录与报告： 详尽记录所有实验细节、原始数据和计算结果。

结论： 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）作为遗传毒性评价体系的核心组成部分，因其方法成熟、成本效益高、标准化程度好，在全球范围内被监管机构和工业界广泛采纳。通过科学严谨的实验设计、规范的操作流程和准确的结果判定，该试验为识别潜在遗传毒性风险物质提供了至关重要的第一手数据，是保障人类健康和环境安全的重要科学工具。其结果需结合体外哺乳动物细胞试验和体内试验进行综合评估。

图示说明（文字描述）：

• 图示1：试验原理示意图。
  • 左侧：组氨酸缺陷型菌株（his⁻）在含有限组氨酸的顶层琼脂中生长形成微弱背景菌苔后无法继续生长。
  • 右侧：诱变剂引起his基因回复突变（his⁺），回复突变菌株可合成组氨酸，在背景菌苔上形成肉眼可见的菌落。
• 图示2：典型平板结果示意图。
  • 阴性对照平板：背景菌苔上散布少量自发回变菌落。
  • 阳性对照平板：背景菌苔上密集分布大量回复突变菌落。
  • 受试物剂量梯度平板：低剂量（接近阴性对照） -> 中剂量（菌落数升高） -> 高剂量（菌落数显著升高，可能伴随背景菌苔变薄）。
  • 高剂量毒性平板：背景菌苔消失或极薄，无或极少菌落（提示细胞毒性抑制了突变体生长）。