细菌回复突变试验(Ames 试验)

细菌回复突变试验（Ames 试验）：检测化学诱变性的经典工具

背景与定义

细菌回复突变试验，通常以其开发者的名字被称为 Ames 试验，是遗传毒理学领域的一项里程碑式的体外短期试验方法。该试验由 Bruce Ames 及其同事于 1970 年代初期建立和发展，主要用于快速、经济、有效地筛查化学物质（包括环境污染物、药物、食品添加剂、化妆品成分、工业化学品等）潜在的致突变性。由于许多诱变剂同时也是致癌物，Ames 试验被广泛用作致癌物的初筛手段。

核心原理

Ames 试验的核心原理是利用特定组氨酸营养缺陷型（his⁻）的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）菌株或色氨酸营养缺陷型（trp⁻）的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株（但沙门氏菌株更为常用）。这些菌株在关键的组氨酸（或色氨酸）合成基因上发生了突变，导致它们自身无法合成生长所必需的组氨酸（或色氨酸）。

• 营养缺陷状态 (his⁻/trp⁻)： 在缺乏外源组氨酸（或色氨酸）的基本培养基上，这些突变菌株不能生长形成肉眼可见的菌落。
• 回复突变 (his⁺/trp⁺)： 当诱变剂作用于这些菌株时，有可能诱导其 DNA 发生回复突变，使原本失活的组氨酸（或色氨酸）合成基因功能得以恢复。发生回复突变的细菌重新获得了在基本培养基上独立合成必需氨基酸的能力，从而能够在缺乏外源组氨酸（或色氨酸）的基本培养基上生长并形成菌落。
• 检测基础： 试验通过计数暴露于受试物后，在基本培养基上生长的回复突变菌落（回复子）数量，并与自发回复突变（未处理对照组）的数量进行比较。如果受试物处理组的回复子数量显著且剂量依赖性地高于自发回复水平，则表明该受试物具有致突变性。

关键试验组分

1. 测试菌株： 使用一组精心设计的沙门氏菌株（通常称为 TA 系列，如 TA98, TA100, TA1535, TA1537, TA102 等）。这些菌株具有以下特性：

   • his⁻ 突变（特定碱基替换或移码突变）。
   • uvrB 缺失突变（切除修复系统缺陷），增加其对 DNA 损伤的敏感性。
   • 部分菌株携带 rfa 突变（脂多糖屏障缺陷），使大分子物质更易进入细胞。
   • 部分菌株携带质粒 pKM101（增强误差倾向修复）或 pAQ1（靶点为易氧化位点）。
   • 使用不同突变类型（碱基替换 vs. 移码突变）的菌株组合，提高检测不同类型突变的能力。

2. 受试物： 待检测的化学物质。通常设置多个剂量组，包括可能产生细胞毒性的剂量（可通过背景菌苔的稀疏度判断），以考察剂量-反应关系。

3. 代谢活化系统（S9 Mix）： 哺乳动物（通常是大鼠）肝脏经酶诱导剂（如多氯联苯或苯巴比妥联合 β-萘黄酮）处理后制备的肝微粒体组分（S9），与辅助因子（NADPH 再生系统）混合而成。该系统旨在模拟哺乳动物体内的肝脏代谢过程。许多化学物质本身不具有诱变性（前诱变剂），但经过体内代谢酶（如细胞色素 P450 酶系）活化后会产生具有诱变活性的中间产物。因此，Ames 试验通常在 加 S9（模拟代谢活化） 和 不加 S9（检测直接诱变剂） 两种条件下分别进行，以全面评估受试物的潜在遗传毒性。

4. 阳性对照物： 已知对特定菌株具有强诱变性的物质（如叠氮钠、甲基磺酸甲酯、2-氨基芴、苯并[a]芘等），用于验证试验系统的灵敏度和有效性。常作为阳性对照物的物质包括：

   • 直接诱变剂：如叠氮钠（碱基置换型）、甲基磺酸甲酯（烷化剂）、硝基芴（移码型）。
   • 间接诱变剂（需代谢活化）：如 2-乙酰氨基芴（2-AAF）、苯并[a]芘（BaP）。

5. 阴性对照（溶剂对照）： 只含溶解受试物和阳性对照物的溶剂（如无菌水、二甲基亚砜 DMSO、丙酮等），用于确定自发回复突变水平。

标准试验方法（平板掺入法）

这是最常用的方法：

1. 制备顶层琼脂： 融化含有少量组氨酸（或色氨酸）和生物素的顶层琼脂，保温备用（约 45°C）。其中微量的组氨酸（或色氨酸）允许细菌完成有限的几次分裂（背景菌苔形成），这对于突变表达是必要的，但不足以支持持续生长形成菌落。
2. 混合反应体系： 在无菌小试管中顺序加入：
   • 一定体积的测试菌液（通常处于对数生长期）。
   • 受试物溶液（或阳性对照物、阴性对照溶剂）。
   • 代谢活化系统 S9 Mix（如需要）或磷酸盐缓冲液（不加 S9 时）。
3. 加入顶层琼脂： 迅速将上述混合物倒入保温的顶层琼脂管中，混匀。
4. 倾注平板： 立即将顶层琼脂混合物倾倒在最低葡萄糖基本培养基平板上，轻轻旋转铺平。
5. 培养： 待顶层琼脂凝固后，将平板倒置放入 37°C 恒温培养箱中，避光培养 48-72 小时。
6. 计数菌落： 培养结束后，人工或借助菌落计数器计数每块平板上生长的回复突变菌落数量。

结果判定与解释

1. 剂量-反应关系： 诱变性通常表现为回复子菌落数随受试物浓度的增加而显著增加，并呈现剂量依赖关系。
2. 显著性判断： 通常认为，如果受试物在至少一个测试菌株上（无论加 S9 或不加 S9），其单个或多个剂量点的回复子平均数达到或超过自发回复子平均数（溶剂对照组）的 2 倍以上（即回复子数 ≥ 2 × 自发回复数），并且在统计学上具有显著性差异（p < 0.05），并且存在明确的剂量-反应关系，则可判定该受试物在该试验条件下对该菌株为阳性结果（致突变性）。
3. 可重复性： 阳性结果应在独立的重复试验中得到证实。
4. 菌株特异性： 致突变性结果可能仅出现在特定类型的菌株上（如 TA98 检出移码诱变剂，TA100 检出碱基置换诱变剂）。
5. 细胞毒性： 过高的剂量可能导致细胞死亡（表现为背景菌苔极度稀疏甚至消失），此时回复子数减少不能作为阴性结果，需结合剂量设置和菌苔情况综合判断。
6. 综合结论： Ames 试验的结果报告通常是针对每个菌株在加 S9 和不加 S9 条件下分别给出阳性或阴性的结论。最终的遗传毒性风险评估需要综合考虑所有菌株的结果。

应用与价值

1. 致癌物初筛： Ames 试验与致癌性有高度的相关性（约 80-90%的已知啮齿类动物致癌物在 Ames 试验中呈阳性），是目前国际上公认且应用最广泛的致癌物初筛试验之一。
2. 遗传毒性评价： 直接评估化学物质引起基因突变的能力，是化学品（工业化学品、农药）、药品、化妆品、食品添加剂和新材料等安全性评价中遗传毒性测试组合的核心组成部分（如 ICH、OECD、EPA 等国际指南均要求）。
3. 环境监测： 用于检测水源、土壤、空气等环境介质中混合污染物的遗传毒性。
4. 基础研究： 研究化学物质的致突变机制、代谢活化途径等。
5. 优势：
   • 快速经济： 周期短（几天），成本远低于长期动物致癌试验。
   • 灵敏度高： 能检测出很低浓度的诱变剂。
   • 通量大： 适用于大量化学物质的初步筛选。
   • 机制明确： 直接检测基因点突变（回复突变）。

局限性与注意事项

1. 假阴性与假阳性：
   • 假阴性： 有些致癌物（如某些激素、免疫抑制剂、过氧化物酶体增殖剂、固体致癌物）可能不直接损伤 DNA 或不能被细菌测试系统有效检测（如非遗传毒性致癌物）。
   • 假阳性： 并非所有 Ames 试验阳性的物质都是哺乳动物致癌物（如某些天然物质、一些强氧化剂）。一些非致癌物也可能在特定条件下产生阳性结果。
2. 体外系统的差异： 细菌细胞不同于哺乳动物细胞（如 DNA 修复能力、代谢酶谱、染色体结构）。细菌缺乏完整的哺乳动物细胞代谢功能，依赖 S9 Mix 模拟，但仍存在差异。检测不到某些需要特定组织代谢或影响染色体结构的物质。
3. 菌株局限性： 即使使用标准菌株组合，也不能检测所有类型的遗传损伤（如大的缺失、重排、非整倍性）。
4. 预测的不确定性： Ames 试验阳性结果提示该物质具有遗传毒性潜能和潜在的致癌风险，需要结合其他体内外遗传毒性试验（如微核试验、染色体畸变试验、彗星试验）以及长期动物致癌试验结果进行综合风险评估。Ames 试验阴性结果不能完全排除该物质的致癌可能性。

结论

细菌回复突变试验（Ames 试验）因其原理清晰、方法相对简便、成本低廉、快速灵敏，并且与致癌性具有良好相关性，在过去近半个世纪中一直是遗传毒理学研究和化学品安全性评价不可或缺的核心工具。它为识别潜在的人类致癌物和诱变剂提供了至关重要的第一层防护网。然而，理解其原理、熟练掌握标准操作、合理选择菌株和剂量、正确解读结果（尤其考虑到其局限性并综合其他试验数据），对于有效利用 Ames 试验进行可靠的风险评估至关重要。它通常作为复杂的遗传毒性测试组合中的第一步，为后续更深入的研究和决策提供关键信息。