急性吸入毒性试验（小鼠）
1. 引言
急性吸入毒性试验旨在评估实验动物单次短时间（通常为4小时）暴露于受试物气体、蒸气、气溶胶或颗粒物后，所产生的急性毒性效应。该试验对于危害识别、危险度评估、化学物质安全分级与标签、制定职业接触限值以及应急响应措施的制定至关重要。其核心目标是确定受试物的半数致死浓度（LC50），即在该暴露条件下预计导致50%试验动物死亡的浓度，并提供毒性体征特征、发生时间、持续时间、可逆性以及靶器官等信息。
2. 材料与方法
- 2.1 受试动物：
- 种属品系： 首选健康成年小鼠（Mus musculus），常用品系如ICR、KM、BALB/c等。应说明具体使用的品系。
- 性别与数量： 通常使用两种性别的动物，除非有证据表明仅一种性别对受试物敏感。每组每种性别至少5只动物。设置足够数量的浓度组（通常4-5个）以计算LC50，另设溶媒/空气对照组。
- 年龄体重： 通常选用8-12周龄的年轻成年动物。同性别动物体重差异应不超过平均体重的±20%。试验前动物需检疫适应至少5天。
- 饲养管理： 动物饲养于符合国家实验动物福利与使用指南的设施中，提供标准饲料和清洁饮水，自由采食饮水（暴露期间除外）。环境条件（温度22±3°C，相对湿度30-70%，光照周期12小时明/12小时暗）需严格控制并记录。
- 2.2 受试物：
- 特性描述： 明确受试物的化学名称、CAS号（若有）、结构式、纯度/浓度、物理形态（气体、液体、固体粉末）、挥发性、稳定性、溶解度等关键理化性质。
- 配制： 详细说明暴露气氛的生成方法（如：液体挥发法、喷雾法、粉尘发生法等）。若使用溶剂或载体，需选择毒性低且不影响受试物吸收或稳定性的种类（如生理盐水、玉米油、羧甲基纤维素钠水溶液等），并设立相应的溶媒对照组。
- 2.3 主要设备：
- 吸入暴露系统： 采用动态气流式染毒柜（如口鼻式暴露塔或全身暴露舱）。系统需保证暴露浓度稳定、分布均匀、温湿度可控、有足够换气次数（通常>12次/小时）。配备精确控制的气流发生与调节装置（流量计、质量流量控制器）。
- 浓度监测系统： 配备实时在线（如红外光谱IR、光离子化检测器PID）和/或离线采样分析（如高效液相色谱HPLC、气相色谱GC、称重法、化学分析法等）设备，准确测定并记录整个暴露期间染毒柜内受试物的实际浓度（时间加权平均浓度，TWA）。
- 环境参数监测： 实时监测并记录暴露柜内的温度、相对湿度、气流速度和压力。
- 动物观察设备： 配备用于观察动物体征、行为、死亡情况的设备（如摄像头、观察窗）。
- 2.4 试验步骤：
- 预试验： 根据受试物理化性质及有限毒性数据（如有），进行预试验以确定正式试验的浓度范围（最低浓度应不致死，最高浓度应引起部分或全部死亡）。
- 分组与标记： 将检疫合格的动物随机分配到各剂量组和对照组。采用适当方法（如耳标、耳打孔、皮下植入芯片）对动物进行唯一性标记。
- 禁食（可选）： 根据试验方案要求，全身暴露时通常在暴露前适当禁食（如4-6小时），以减少胃内容物对氨气产生的影响；口鼻式暴露通常无需禁食。
- 暴露：
- 将动物置于预平衡好的染毒柜中。
- 启动气流，按设定浓度通入受试物（或洁净空气），开始计时。标准暴露时间通常为连续4小时。实时监测并记录浓度、温湿度等参数。
- 暴露后观察：
- 密集观察期： 暴露结束后立即移出动物，放回清洁笼具。在最初的24-48小时内进行多次（如暴露后0.5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h）密切观察，记录中毒体征、出现和消失时间、严重程度及死亡情况。观察内容包括但不限于：
- 中枢神经系统：兴奋、抑制、震颤、抽搐、共济失调、昏迷等。
- 自主神经系统：流泪、流涎、竖毛、瞳孔大小变化（缩瞳/散瞳）等。
- 呼吸系统：呼吸频率/深度改变（急促、困难、缓慢）、鼻分泌物、紫绀等。
- 消化系统：腹泻、呕吐（小鼠罕见呕吐，但可能有干呕动作）。
- 其他：姿态异常、皮毛状况、眼睑闭合、异常发声等。
- 死亡动物处理： 及时记录死亡时间。对濒死动物实施安乐死并记录。
- 体重记录： 在暴露前、暴露后即刻（或第1天）、第7天和第14天（或试验终点）称量并记录个体体重。
- 长期观察期： 密集观察期后，每天至少观察一次动物的一般状态、体征恢复情况及死亡，直至试验结束（通常为暴露后14天）。
- 密集观察期： 暴露结束后立即移出动物，放回清洁笼具。在最初的24-48小时内进行多次（如暴露后0.5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h）密切观察，记录中毒体征、出现和消失时间、严重程度及死亡情况。观察内容包括但不限于：
- 病理检查：
- 大体剖检： 所有试验期间死亡或濒死处死的动物，以及试验结束时存活的动物（进行安乐死）均需进行系统的肉眼大体剖检。仔细检查体表、体腔、胸腹腔脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、性腺、胃肠道等）有无形态、颜色、大小、质地等异常，并记录。
- 组织病理学检查（可选/必要时）： 根据大体剖检发现的肉眼病变、中毒体征提示的靶器官以及研究目的，选取关键器官（特别是呼吸道和相关脏器）进行固定（如10%中性福尔马林）、石蜡包埋、切片、染色（如H&E）和显微镜检查。通常在高剂量组和对照组，以及发现异常的低剂量组进行。有助于深入了解毒性机制和靶器官损伤性质。
3. 数据处理与结果分析
- 3.1 临床观察： 详细描述各剂量组动物在观察期内出现的毒性体征（种类、发生率、严重程度、发生时间、持续时间、恢复情况）。
- 3.2 死亡率： 记录各剂量组在各观察时间点（特别是暴露后14天）的死亡动物数。
- 3.3 体重变化： 计算并分析各剂量组动物在各称重时间点相对于暴露前的平均体重变化及变化率。体重变化是反映动物整体健康状况的重要指标。
- 3.4 病理学发现：
- 系统描述大体剖检所见病变（器官、性质、严重程度、发生率）。
- 简述组织病理学检查结果（如有），说明镜下观察到的病变及其与受试物暴露的可能关联。
- 3.5 LC50计算：
- 使用适当的统计学方法（如Bliss法、Probit法、移动平均法、Weibull回归等）计算暴露后14天的LC50值及其95%置信区间（95% CI）。
- 报告中清晰说明所用计算方法。
4. 试验结论
- 明确给出受试物对小鼠进行4小时急性吸入暴露后的主要试验结果，包括：
- LC50值及95% CI： 这是核心结果。
- 主要中毒体征及其特点： 描述最具特征性或最敏感的体征。
- 主要靶器官（如能确定）： 结合临床观察和病理学结果推断。
- 死亡发生的时间模式： 是速发还是迟发。
- 毒性效应的可逆性或持续性。
- 受试物急性吸入毒性的强度分级： （根据GB 30000.1-2013《化学品分类和标签规范》等相关标准或内部标准进行初步分级，例如：剧毒、高毒、中等毒、低毒、微毒）。
- 结论应清晰、简洁、基于数据。
5. 试验报告
完整试验报告应包含但不限于以下内容：
- 试验名称、目的、遵循的指导原则（如OECD TG 412）。
- 受试物信息（名称、CAS号、批号、纯度、理化性质、配制方法）。
- 实验动物信息（种属品系、来源、性别、数量、年龄体重范围、检疫适应情况、饲养条件）。
- 试验方法细节（暴露系统类型及描述、浓度生成与分析监测方法、暴露浓度实测值及稳定性、暴露持续时间、环境参数、分组情况、观察指标及频率、尸检及病理学检查方案）。
- 详细试验结果（原始数据和汇总数据）：体征观察记录表、体重记录表、死亡记录表、大体剖检记录表、组织病理学报告（如有）、LC50计算结果（含计算方法和过程）。
- 结果分析（与对照组比较、剂量-效应/反应关系、病理发现的生物学意义）。
- 结论。
- 试验日期和环境条件摘要。
- 试验负责人和参与人员签名。
- 所有原始数据和记录的保存地点说明。
6. 动物福利与伦理
- 试验必须在获得机构动物伦理委员会（IACUC）批准后进行。
- 严格遵守“3R原则”（替代Replacement、减少Reduction、优化Refinement）。
- 选用科学合理的最小动物数量。
- 采取一切措施减轻动物疼痛和痛苦（如设置人道终点、必要时及时安乐死）。
- 确保动物饲养和使用环境符合国家标准。
7. 安全性
- 整个试验操作（受试物配制、动物操作、染毒系统操作、样本处理、废物处置）必须严格遵守实验室安全规程。
- 操作人员需佩戴合适的个人防护装备（PPE），如防护服、手套、防护眼镜/面罩，在通风橱或生物安全柜内进行高风险操作。
- 确保染毒系统密闭性良好，配备排气处理装置（如活性炭吸附、高效过滤器）以减少对实验室环境和人员的污染风险。