体外埔乳动物细胞染色体琦变试验

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：原理、方法与意义

摘要： 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是利用培养的哺乳动物细胞株，检测化学物质或物理因素诱发染色体结构畸变能力的标准化遗传毒性试验方法。该试验是评估物质潜在遗传毒性和致癌风险的重要组成部分。

一、 引言 遗传物质（DNA）的完整性对于生物体至关重要。染色体是DNA的主要载体，其结构的稳定性直接影响细胞的正常功能和遗传信息的准确传递。环境中存在众多化学物质和物理因素（如辐射），可能通过直接或间接作用损伤DNA，导致染色体断裂、重排等结构异常，即染色体畸变。染色体畸变是遗传毒性物质作用的标志性事件之一，与基因突变、癌症发生及生殖细胞风险密切相关。体外哺乳动物细胞染色体畸变试验就是设计用来快速、有效地筛查受试物诱导此类损伤的能力。

二、 试验原理 该试验基于以下核心原理：

1. 细胞模型： 使用可在体外连续传代培养的哺乳动物细胞系（如中国仓鼠肺细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人外周血淋巴细胞等）。这些细胞具有完整的细胞周期调控机制和代谢能力。
2. 暴露与处理： 将处于增殖状态的细胞暴露于不同浓度的受试物中。为了模拟体内代谢活化过程，通常在试验体系中加入啮齿类动物肝脏来源的代谢活化系统（如S9混合液），使某些需要代谢激活的前致突变物/前致畸物转化为活性形式。
3. 细胞周期阻滞： 在暴露期结束前的适当时间（通常在收获前1.5-2小时），加入纺锤体抑制剂（常用秋水仙素或秋水仙胺）。该药物能阻止细胞分裂进入有丝分裂后期，使大量处于分裂中期的细胞累积——这是观察染色体形态的最佳时期。
4. 染色体标本制备： 收获细胞，经低渗溶液处理（使细胞膨胀，染色体分散），固定（常用甲醇:冰醋酸混合液），滴片，染色（常用Giemsa染色）。
5. 畸变观察与分析： 在光学显微镜下系统观察处于有丝分裂中期的细胞，记录染色体结构畸变的类型和频率。分析时需满足一定的中期分裂相计数要求（通常每组至少分析100-200个结构清晰的分裂相）。

三、 主要步骤与方法要点

1. 细胞培养与准备：

   • 选择适宜的细胞系并确认其无支原体污染。
   • 在标准条件下常规培养细胞。
   • 试验前一天或当天，将细胞以适当密度接种于培养容器（如培养瓶、培养皿或多孔板），确保细胞在暴露期间处于指数生长期和活跃分裂状态。

2. 受试物制备与暴露：

   • 受试物溶解或悬浮于合适的溶剂（首选水或无细胞毒性的溶剂，如DMSO、丙酮、乙醇，浓度尽量低）或培养基中（用于水溶性物质）。
   • 设置多个浓度的受试物处理组。浓度范围应覆盖从无明显细胞毒性的浓度到能产生一定细胞毒性（如抑制细胞生长50%左右）的浓度。通常设置3个或以上剂量组。
   • 设立阳性对照组（已知能诱导染色体畸变的物质，如丝裂霉素C或环磷酰胺加S9）和阴性（溶剂/空白）对照组。
   • 暴露时间通常为3-6小时（短期处理）。对于某些特殊目的，也可采用持续处理直至收获（约覆盖1.5个正常细胞周期，如1.5小时+17小时）。
   • 需进行两组平行试验：一组不加代谢活化系统（-S9），一组加代谢活化系统（+S9）。

3. 恢复与收获：

   • 短期暴露结束后，弃去含受试物的培养基，用缓冲液清洗细胞，加入新鲜完全培养基。
   • 细胞恢复培养一定时间（通常使其经历约1.5个正常细胞周期，例如17-22小时），以使受试物造成的DNA损伤有机会在细胞进入分裂期时表现为染色体畸变。
   • 在预定收获时间前1.5-2小时，向培养物中加入纺锤体抑制剂。

4. 染色体制备：

   • 收获细胞：通常采用胰蛋白酶消化贴壁细胞或用移液管吹打悬浮细胞。
   • 低渗处理：将细胞悬浮于预温的低渗溶液（常用0.075 M KCl）中，在37℃作用一定时间（如10-30分钟），使细胞胀大，染色体分散。
   • 预固定：加入少量固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）预固定细胞，有助于维持细胞形态。
   • 离心、固定：离心弃上清，加入新鲜固定液，混匀，冰上固定（通常重复固定2-3次，每次不少于15-30分钟）。
   • 滴片：将固定好的细胞悬液滴加在洁净、预冷的载玻片上，空气干燥。
   • 染色：常用Giemsa染色液染色一定时间，自来水轻柔冲洗，晾干。

5. 镜检与结果分析：

   • 在光学显微镜下（通常1000倍油镜）系统扫描制备好的染色体标本。
   • 仅分析处于有丝分裂中期的细胞（染色体形态清晰可辨）。
   • 识别并记录每个中期细胞中存在的染色体结构畸变类型和数量。
   • 记录观察到的中期细胞总数、含畸变染色体的细胞数以及不同类型的畸变总数。
   • 计算畸变率（含畸变细胞百分比）和每个细胞的平均畸变数。
   • 采用适当的统计学方法比较各处理组与阴性对照组的差异显著性（如卡方检验、Fisher精确检验、Dunnett检验等）。

四、 染色体畸变类型 主要分为两大类：

1. 染色体型畸变： 涉及染色体两条染色单体的相同位置同时受损。
   • 断裂型畸变：
     • 染色体断裂：单个染色体完全断裂产生的无着丝粒断片和有着丝粒断片。
     • 微小体：成对的、小的无着丝粒断片。
   • 重排型畸变：
     • 双着丝粒体：两个染色体断裂后，两个带着丝粒的片段错误连接形成的具有两个着丝粒的异常染色体，常伴有断片。
     • 环状染色体：染色体两端断裂后，两个断裂端连接形成的环状结构。
     • 易位：非同源染色体之间交换片段（在常规Giemsa染色下难以识别所有类型）。
     • 倒位：染色体内部片段发生180度旋转（常规Giemsa染色下难以识别）。
2. 染色单体型畸变： 只涉及一条染色单体受损。
   • 染色单体断裂
   • 染色单体交换（包括不对称交换形成三辐体、四辐体等复合畸变）
   • 染色单体缺失

五、 结果判定 试验有效性标准：

• 阴性对照组应具有本实验室历史数据的背景畸变率（通常在0-5%范围内）。
• 阳性对照组必须显示畸变率显著高于阴性对照。
• 试验剂量范围应包括细胞毒性剂量（如相对细胞计数或相对细胞生长抑制率在50%±5%范围内）。

受试物结果判定（遵循国际公认指南）：

• 阳性结果： 至少在一个浓度水平（无论是否加入S9代谢活化系统），畸变率（含畸变细胞率）与阴性对照相比有统计学显著性的增加（P<0.05），并且这种增加具有剂量依赖性（或有意义的重现性）。
• 阴性结果： 在所有测试浓度下（包括达到适当细胞毒性的浓度），受试物组畸变率与阴性对照组相比均无统计学显著性的增加。
• 可疑结果： 畸变率有增加，但未达到统计学显著性水平；或仅在个别高浓度出现临界显著性增加，但无剂量依赖性。可疑结果通常需要重复试验或进一步研究。

六、 应用与意义

1. 遗传毒性筛查： 是国际通用的核心遗传毒性试验组合（通常与Ames试验、小鼠淋巴瘤试验或微核试验组成组合）之一，用于评估化学品、药品、农药、食品添加剂、化妆品原料等的潜在遗传毒性。
2. 致癌风险预警： 许多遗传毒性致癌物能诱导染色体畸变，该试验阳性提示受试物具有潜在的致癌风险，需高度关注。
3. 生殖细胞风险评估： 虽然主要在体细胞中进行，但阳性结果也可提示该物质可能对生殖细胞DNA造成损伤，存在潜在的遗传性风险。
4. 机制研究： 不同类型的染色体畸变有助于了解受试物损伤DNA的作用机制（如断裂剂、交联剂、纺锤体毒物等）。
5. 环境与职业健康： 监测环境污染物和工作场所化学品的遗传毒性风险。

七、 优势与局限性

• 优势：
  • 直接观察遗传物质的结构完整性损伤。
  • 可检测多种类型的染色体结构异常。
  • 代谢活化系统的引入提高了检出需要代谢激活物质的敏感性。
  • 技术相对成熟、标准化程度高。
• 局限性：
  • 体外系统无法完全模拟体内复杂的吸收、分布、代谢和排泄过程。
  • 主要反映致断裂作用，对点突变和非整倍体诱导剂的检测能力有限（需配合其他试验）。
  • 结果判定需要专业的细胞遗传学知识和经验。
  • 假阳性或假阴性结果均有可能发生（如高浓度细胞毒性导致的继发性效应可能引起假阳性）。
  • 无法直接评估对生殖细胞的风险。

结论： 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是一种重要的遗传毒性终点检测方法，具有直接、敏感、相对快速的特点。通过观察受试物诱导的染色体结构损伤，能够有效地识别具有潜在遗传毒性和致癌风险的化学物质及物理因素。其结果对于化学品的危害识别、安全性评价和风险管理具有重要的指导价值。然而，其结果解释应结合其他遗传毒性试验结果、毒代动力学数据以及整体毒性评价进行综合分析。该试验作为遗传毒性评价体系中的关键环节，在保障人类健康和环境安全方面发挥着不可替代的作用。