体外哺乳动物细胞基因突变试验：原理与应用
一、引言
体外哺乳动物细胞基因突变试验是遗传毒理学研究中的核心方法之一，用于评估化学物质、药物、环境污染物等受试物诱发哺乳动物体细胞基因水平突变的能力。该试验模拟体内环境，利用培养的哺乳动物细胞系，直接检测受试物对特定基因位点的致突变作用，为评估物质的潜在遗传危害和致癌风险提供重要的科学依据。因其相对快速、经济、可控性强且符合动物福利的“3R”原则（替代、减少、优化），该试验在化学品安全评估、药物研发、环境监测等诸多领域被广泛应用。
二、试验原理
该试验的核心在于检测受试物是否能诱发培养的哺乳动物细胞基因组中特定基因位点发生稳定的、可通过表型改变进行筛选的突变。其基本原理可概括为：
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靶基因选择： 通常选用具有明确功能的基因作为“报告基因”。最常用的基因座包括：
- 胸苷激酶 (TK) 基因： 位于常染色体（如小鼠淋巴瘤L5178Y细胞）。TK酶参与核苷酸补救合成途径。正常细胞（TK⁺/⁺或TK⁺/⁻）能利用培养基中的胸苷。TK基因发生突变（TK⁻/⁻）导致酶失活，细胞无法利用胸苷，但可在选择性培养基（含三氟胸苷 - TFT）中存活，因为TFT在TK⁺细胞中被磷酸化为毒性产物而杀死细胞，TK⁻突变细胞则不受影响。
- 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HPRT) 基因： 位于X染色体（如中国仓鼠卵巢CHO细胞、中国仓鼠肺V79细胞等）。HPRT酶同样参与嘌呤核苷酸补救合成。正常细胞（HPRT⁺）能利用次黄嘌呤。HPRT基因突变（HPRT⁻）导致酶失活，细胞无法利用次黄嘌呤，但能在含有嘌呤类似物6-巯基鸟嘌呤（6-TG）或8-氮杂鸟嘌呤（8-AG）的选择性培养基中存活，因为这些类似物在HPRT⁺细胞中被磷酸化而具有毒性，杀死细胞，而HPRT⁻突变细胞则能存活。
- 黄嘌呤磷酸核糖转移酶 (XPRT) 基因： 位于常染色体（如AS52细胞系，是CHO细胞的一个亚系）。其原理类似于HPRT，利用嘌呤类似物进行选择。
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突变事件检测： 受试物处理细胞后，若引起上述靶基因发生功能性失活突变（如点突变、小缺失、插入、染色体丢失或重排等），则突变细胞失去相应酶活性。将这些细胞接种到含有相应毒性核苷类似物（TFT、6-TG或8-AG）的选择性培养基中培养。只有携带目标基因功能缺失突变的细胞才能在这种选择性条件下存活并形成克隆（细胞集落），而正常野生型细胞则被杀死。
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突变频率计算： 通过计数在选择性培养基上形成的突变克隆数与非选择性培养基上形成的总存活克隆数（代表接种的有活力细胞数），计算突变频率（Mutant frequency, MF）：
MF = (突变克隆数 / 接种细胞数) x 克隆形成效率校正因子克隆形成效率 (Plating Efficiency, PE) = (非选择性平板上形成的克隆数 / 接种细胞数) x 100%
三、试验系统
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常用细胞系：
- L5178Y TK⁺/⁻ 小鼠淋巴瘤细胞： 用于检测TK基因座突变。特别适用于检测能引起染色体水平损伤（如染色体断裂、丢失）的物质，因为TK基因位于常染色体上。
- CHO 细胞、V79 细胞： 主要用于检测HPRT基因座突变（因是单倍体功能基因）。应用广泛，操作相对简便。
- AS52 细胞： CHO细胞的衍生系，含单一拷贝的细菌gpt基因（功能类似XPRT），用于检测gpt基因座突变。对某些类型的诱变剂可能更敏感。
- 人类淋巴母细胞 TK6： 含功能性TK基因（杂合子TK⁺/⁻），适用于TK检测，并提供更接近人类的遗传背景数据。
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代谢活化系统（S9 Mix）：
- 必要性： 许多化学物质需要经过体内代谢（代谢活化）才能转化为具有遗传毒性的终诱变剂。体外培养的细胞通常缺乏足够的代谢活性。
- S9 组分： 通常使用经酶诱导剂（如Aroclor 1254或苯巴比妥/β-萘黄酮）处理的大鼠肝脏匀浆后的上清液（S9）。
- S9 Mix： S9组分与辅因子（NADPH再生系统、Mg²⁺、K⁺、葡萄糖-6-磷酸等）混合而成，模拟哺乳动物的肝脏代谢环境。
- 应用： 试验通常在加有S9 Mix（模拟代谢活化条件）和不加S9 Mix（直接作用条件）两种条件下进行，以全面评估受试物的潜在遗传毒性。
四、标准试验流程
典型的试验流程遵循国际公认的规范（如经济合作与发展组织测试准则 OECD TG 490）：
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细胞培养与准备： 在适宜培养基（如RPMI 1640, MEM等）中常规培养选定的细胞系，维持良好的生长状态和对目标基因座的选择剂的敏感性。
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细胞处理（暴露）：
- 处理时间： 通常持续3-6小时（短时处理），对于代谢较慢的物质或特定检测目的可能需要延长至24小时或更长时间（延长处理）。
- 浓度设置： 设置多个剂量组（至少4个浓度），覆盖从无明显细胞毒性到接近50-80%存活率抑制（即细胞毒性剂量范围）的浓度。同时设立阴性（溶剂对照）和阳性对照组（已知诱变剂，如甲磺酸甲酯MMS -S9，苯并[a]芘B[a]P +S9）。
- 代谢活化： 部分处理在含S9 Mix的条件下进行，部分在不含S9 Mix的条件下进行（通常使用缓冲液代替）。
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表达期：
- 处理结束后，移除含受试物的培养基，清洗细胞。
- 细胞在新鲜、非选择性完全培养基中培养数天（通常7-10天）。这段时间至关重要，它允许：
- 细胞从可能的毒性损伤中恢复。
- 受试物及其代谢物被清除。
- 细胞修复可能存在的DNA损伤（非突变性损伤可能被修复）。
- 突变基因的表达：使诱导产生的突变在表型上得以固定和显现（即目标酶活性丧失）。
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克隆形成（选择期）：
- 测定存活率（克隆形成效率 - PE）： 将适量细胞接种到不含选择剂（非选择性）的培养基培养皿中，培养7-10天。计数形成的克隆数，计算PE。
- 测定突变频率（MF）： 同时将大量细胞（通常是存活率测定接种量的10倍或更多）接种到含有相应毒性选择剂（如TFT、6-TG）的培养基培养皿中，培养10-14天。计数在选择性条件下存活并形成的克隆数。
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数据处理与分析：
- 计算各剂量组的相对存活率（处理组非选择性平板PE / 溶剂对照组非选择性平板PE）x 100%。
- 计算各剂量组的突变频率（MF）。
- 结果判定：
- 阳性结果： 突变频率呈现出剂量依赖性增加（或可重复的增加），且至少在一个浓度点上达到或超过历史阴性对照范围上限（或达到预先设定的生物学显著性阈值，如2倍或3倍于溶剂对照平均值），同时该浓度点的存活率通常应高于一定水平（如10%）。
- 阴性结果： 在达到足够细胞毒性的浓度范围内（存活率降至10-20%），所有测试浓度的突变频率均未呈现剂量依赖性增加，且未显著超过历史阴性对照范围。
- 无效结果： 细胞毒性过高（最高剂量存活率过低），未达到足够的测试浓度范围，或存在干扰因素导致结果无法解释。
五、结果解释与应用
- 遗传毒性预警： 阳性结果表明该受试物在试验条件下具有诱导哺乳动物体细胞基因突变的潜力，提示其存在遗传毒性风险。这通常需要结合其他遗传毒性试验（如体外微核试验、Ames试验、体内微核试验等）的结果进行综合评估。
- 致癌风险预测： 基因突变是癌症发生的关键起始事件之一。体外哺乳动物细胞基因突变试验的阳性结果常被视为物质潜在致癌性的一个警示信号。
- 安全性评价： 是化学品注册（如REACH法规）、新药研发临床前安全性评价（ICH指导原则）、农药登记、食品安全风险评估等法规体系中不可或缺的组成部分。
- 机制研究： 有助于了解诱变剂的作用机制（如碱基替换、移码突变、大片段缺失等）。
六、优点与局限性
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优点：
- 直接检测哺乳动物细胞基因水平的突变。
- 可模拟代谢活化过程（S9 Mix）。
- 相对快速（数周内完成）、成本较低。
- 高通量潜力。
- 符合动物福利“3R”原则（替代动物试验）。
- 有标准化的国际测试指南（如OECD TG 490）。
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局限性：
- 体外局限性： 无法完全模拟体内的吸收、分布、排泄过程以及复杂的器官间相互作用。
- 代谢活化模拟不足： S9 Mix主要模拟肝脏I相代谢，可能无法完全代表体内代谢谱和II相结合反应。
- 靶基因限制： 只能检测特定基因位点的突变，可能遗漏影响其他基因或基因组不稳定性的物质。
- 细胞系差异： 不同细胞系的遗传背景、修复能力等可能影响结果。
- 假阳性/假阴性风险： 高浓度下的细胞毒性、pH或渗透压改变、过氧化物产生等因素可能导致假阳性；溶解度差、未能达到靶点等因素可能导致假阴性。
- 无法提供器官特异性信息。
七、结论
体外哺乳动物细胞基因突变试验是一项成熟、标准化且应用广泛的遗传毒性评价方法。它通过利用特定基因座的功能缺失突变作为报告终点，有效地筛选和评估化学物质诱导基因水平损伤的能力。虽然存在体外试验固有的局限性，但其在识别潜在致突变物和致癌物方面发挥着不可替代的关键作用，并为后续更深入的机制研究或体内试验提供重要的初步数据。在化学品、药品、消费品等的综合安全评估框架中，该试验结果通常是支持危害识别和风险评估决策的关键科学证据之一。研究人员必须严格遵守标准操作规程，并谨慎结合其他试验数据进行综合判断。