体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

1. 引言

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是一种重要的短期遗传毒性试验方法，广泛应用于化学品、药品、农药、食品添加剂等物质的潜在遗传危害评估。其核心目的在于检测受试物能否诱发哺乳动物细胞在体外培养条件下发生染色体结构损伤（染色体畸变）。这类损伤是致突变性和潜在致癌性的重要指标。该试验是国际公认的标准遗传毒性测试组合（例如ICH S2(R1)指南推荐）中的关键部分，其结果对于物质的安全性评价至关重要。

2. 试验原理

染色体畸变是指染色体在结构上发生的可见异常改变，主要包括：

染色体型畸变： 涉及两条染色单体在同一位置发生断裂或重排（通常发生在细胞周期的G1期或S期早期）。常见类型包括：
- 断裂 (Break)：染色体臂的断裂，末端无着丝粒的断片。
- 微小体 (Minute)：非常小的成对或无着丝粒断片。
- 无着丝粒断片 (Acentric fragment)：无着丝粒的染色体片段。
- 着丝粒环 (Centric ring)：染色体两端断裂后，有着丝粒的部分首尾相接形成环状。
- 双着丝粒体 (Dicentric)：一条染色体上含有两个着丝粒。
- 易位 (Translocation)：非同源染色体间片段的交换（需显带技术确认）。
- 复杂重排 (Complex rearrangement)：涉及多个断裂和重接的复杂结构改变。
染色单体型畸变： 仅涉及一条染色单体发生断裂或重排（通常发生在S期晚期或G2期）。常见类型包括：
- 染色单体断裂 (Chromatid break)：单个染色单体臂的断裂。
- 染色单体交换 (Chromatid exchange)：染色单体之间的片段交换。
- 间隙 (Gap)：染色单体上非染色或浅染区域，其宽度大于染色单体宽度，可能代表DNA损伤但连续性未完全丧失（通常单独记录但赋予较低权重）。

试验通过将培养的哺乳动物细胞暴露于不同浓度的受试物中（通常包含模拟体内代谢的活化系统），利用中期阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）积累分裂中期细胞，制备染色体标本，在显微镜下观察和分析中期分裂相细胞染色体结构的变化，计算畸变细胞率，从而判断受试物诱导染色体损伤的能力。

3. 试验材料与方法

3.1 细胞系：
- 常用细胞系：中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）、人外周血淋巴细胞（HPBL）等。
- 选择依据：细胞遗传学背景清晰、核型稳定、分裂指数高、易于培养、对诱变剂敏感。
- 细胞需定期检查支原体污染，确保无菌状态。培养物应有清晰的来源记录和传代历史。
3.2 培养基与试剂：
- 细胞培养基：根据细胞类型选择适宜的基础培养基（如RPMI 1640、MEM、DMEM等），补充胎牛血清（浓度通常为5-10%）、谷氨酰胺、抗生素（如青霉素、链霉素）。
- 受试物与对照物：
  - 受试物：需明确其理化性质（如溶解性、稳定性），选择合适溶剂（如无菌水、生理盐水、DMSO、丙酮等），确保溶解且不干扰细胞活力。需新鲜配制或按要求保存。
  - 阳性对照物：已知能诱发染色体畸变的物质（如丝裂霉素C、环磷酰胺（需代谢活化）、苯并[a]芘（需代谢活化）等）。
  - 阴性（溶剂）对照物：与溶解受试物所用溶剂相同，但不含受试物。
- 代谢活化系统：
  - 目的：模拟哺乳动物体内的肝脏代谢（主要涉及细胞色素P450酶系），将某些前致突变物转化为活性形式。
  - 组成：啮齿类动物（通常为大鼠）肝脏经酶诱导剂（如Aroclor 1254或苯巴比妥/β-萘黄酮）预处理后制备的肝匀浆上清液（S9组分），与辅助因子（NADP、葡萄糖-6-磷酸盐、MgCl₂、KCl、磷酸盐缓冲液）按比例混合成S9混合液（S9 mix）。
  - 应用：通常每个试验设置两组，一组加入S9 mix（+S9），一组不加（-S9），以全面评估受试物在代谢活化和非活化条件下的遗传毒性。
- 中期阻断剂：秋水仙素（colchicine）或秋水仙胺（demecolcine），用于破坏纺锤体微管，阻止细胞进入分裂后期，使分裂细胞停滞在中期。
- 低渗液：低浓度的KCl溶液（0.075 M），使细胞膨胀，染色体分散。
- 固定液：甲醇:冰醋酸（3:1），用于固定细胞和染色体形态。
- 染色液：吉姆萨（Giemsa）染液，用于染色体着色。
3.3 试验设计
- 剂量设置：
  - 需进行剂量范围确定试验（细胞毒性预试验，如相对集落形成率、相对细胞生长率、相对细胞计数或有丝分裂指数测定）。
  - 正式试验设置多个剂量组（通常至少3-4个），剂量范围应从产生轻度细胞毒性（如细胞生长抑制率约50%，或有丝分裂指数降低约50%）的浓度开始向下延伸至无明显细胞毒性的浓度（最高剂量不应超过10 mM或5 mg/mL）。
  - 设置溶剂对照组和阳性对照组（每组均应有+S9和-S9）。
- 暴露与处理：
  - 细胞处理：
    - 贴壁细胞（如CHL, CHO, V79）： 将指数生长期的细胞接种于培养瓶或培养板中。细胞贴壁后，加入含不同浓度受试物、溶剂或阳性对照物的新鲜培养基（含或不含S9 mix）。暴露时间通常为3-6小时（含S9组暴露时间可能更短）。暴露结束后，弃去含受试物的培养基，用缓冲液或PBS清洗细胞，换上不含受试物的新鲜完全培养基。细胞继续培养一定时间（恢复期，通常覆盖约1.5个正常细胞周期），让DNA损伤发展为染色体畸变（例如CHL细胞约18-22小时）。在收获细胞前适当时间（如恢复期结束前1.5-3小时）加入中期阻断剂。
    - 悬浮细胞（如HPBL）： 将新鲜分离或冻存复苏的健康人外周血淋巴细胞接种于含植物血凝素（PHA，刺激T淋巴细胞分裂）的培养液中培养至适宜阶段（通常约44-48小时）。加入含不同浓度受试物、溶剂或阳性对照物的培养基（含或不含S9 mix），暴露处理（通常3-6小时）。之后清洗细胞并更换新鲜含PHA培养基继续培养（恢复期，通常至总培养时间约72小时）。收获前加入中期阻断剂（通常在收获前约1.5-3小时）。
- 细胞收获与染色体标本制备：
  1. 收获： 用胰酶消化贴壁细胞或收集悬浮细胞。
  2. 低渗处理： 将细胞沉淀重新悬浮于预热（37°C）的低渗KCl溶液中，温和混匀，在37°C孵育一定时间（通常10-20分钟，依细胞类型优化），使细胞膨胀。
  3. 预固定： 加入少量新鲜配制的固定液（甲醇:冰醋酸=3:1），轻轻混匀。
  4. 离心： 离心沉淀细胞，弃上清。
  5. 固定： 加入新鲜固定液，重悬细胞，室温放置一定时间（至少15-30分钟）。此步骤重复2-3次。
  6. 滴片： 将细胞悬液滴在洁净、预冷的载玻片上，空气中晾干。
  7. 染色： 用稀释的Giemsa染液染色一定时间（如5-10分钟），流水轻柔冲洗，晾干。
3.4 阅片分析
- 阅片： 在光学显微镜下（通常油镜，1000×）系统性地观察染色体标本。
- 中期细胞选择： 选择染色体数目在正常范围内（或特定细胞系的标准数目附近）、染色体分散良好、形态清晰、未过度收缩或破坏的中期分裂相进行分析。
- 记录畸变： 对每个选定的中期细胞，仔细检查所有染色体，记录观察到的染色体畸变类型（染色体型、染色单体型）和数量。特别注意区分真实的断裂/交换与染色间隙（通常单独记录）。
- 阅片数量： 通常每个试验组（包括每个浓度的+S9/-S9组及对照组）需分析足够数量的中期细胞（通常200个细胞/浓度/培养物，OECD 473指南推荐）。阅片应双盲进行（阅片者不知晓样本分组）。
- 关键指标：
  - 畸变细胞率：含有至少一个染色体型畸变（不包括间隙）的细胞数占所分析中期细胞总数的百分比。
  - 每个细胞的畸变数。
  - 有丝分裂指数（MI）：可作为细胞毒性指标，计算为观察视野中处于中期分裂相的细胞数占总细胞数的百分比（通常在滴片时计数）。

4. 数据分析与结果判定

数据整理： 汇总各试验组畸变细胞率、畸变类型分布、每个细胞畸变数、有丝分裂指数等数据。
统计处理：
- 畸变细胞率数据通常采用适当的统计方法（如Fisher精确检验、卡方检验）与相应的溶剂（阴性）对照组进行比较。
- 应考虑是否存在剂量-反应关系（即畸变率随剂量增加而升高）。
- 有丝分裂指数可用于评估细胞毒性水平（通常剂量组MI不应低于溶剂对照的50%）。
结果判定标准（通常基于畸变细胞率）：
- 阳性结果 (+)：
  1. 一个或多个剂量组畸变细胞率与溶剂对照组相比，差异具有统计学意义（p < 0.05，具体显著性水平遵循试验方案）。
  2. 观察到的畸变率升高具有剂量相关性趋势（非必需但提供更强证据）。
  3. 畸变率升高的幅度通常需达到或超过背景畸变率的2倍（或绝对值增加≥10%，需结合试验室历史阴性对照数据范围具体判定）。
- 阴性结果 (-)：
  1. 所有剂量组的畸变细胞率与溶剂对照组相比，差异均无统计学意义。
  2. 未观察到剂量相关的畸变率升高。
  3. 试验系统有效性得到证实（阴性对照畸变率在历史背景范围内，阳性对照显著诱导畸变，有丝分裂指数显示足够的细胞毒性）。
- 可疑或不确定结果： 畸变率升高具有统计学意义但升高幅度较小（接近临界值），或仅在一个剂量点升高且无剂量关系，或细胞毒性过强影响结果解释等。通常需要重复试验以澄清。

5. 试验的有效性

一次有效的试验须同时满足以下条件：

阴性（溶剂）对照组： 染色体畸变细胞率处于试验室历史背景数据范围内（通常畸变细胞率≤5%）。
阳性对照组： 在代谢活化条件（+S9）和非代谢活化条件（-S9）下，均能显著诱导染色体畸变细胞率升高（通常远高于阴性对照，并与历史阳性对照数据相符）。
细胞毒性： 最高剂量组应表现出一定的细胞毒性证据（如有丝分裂指数降低至阴性对照的50%±5%左右，或达到方案设定的细胞毒性标准）。

6. 试验报告

完整的试验报告应包含以下关键要素：

试验名称、目的、遵循的准则（如OECD 473, ICH S2(R1)）。
受试物信息：名称、编号、理化特性（如结构式、分子量、纯度）、溶剂、配制方法及浓度。
细胞系：名称、来源、培养条件（培养基、血清、温度、CO2浓度等）、支原体检测结果。
代谢活化系统：S9来源（动物种属、诱导剂）、S9 mix配制浓度、辅助因子。
试验设计：剂量设置依据（预试验结果）、正式试验浓度、处理方案（暴露时间、恢复时间）、中期阻断剂浓度与处理时间、每组分析的中期细胞数。
试验步骤：详细描述细胞处理、培养、收获、制片、染色方法。
结果：
- 细胞毒性数据（如相对生长率、有丝分裂指数）。
- 染色体畸变分析的详细数据：每个剂量组分析的细胞总数、含染色体型畸变的细胞数及百分率（按+S9、-S9分别列出）、含染色单体型畸变的细胞数及百分率、含间隙的细胞数及百分率、平均每个细胞的畸变数。
- 典型畸变的显微镜照片（如适用）。
- 统计分析方法及结果。
结论：基于判定标准，明确给出受试物在本试验系统中是否具有诱导染色体畸变作用的结论（阳性、阴性、可疑）。
原始数据记录说明。
试验负责人签名和日期。

7. 质量控制与注意事项

严格遵守无菌操作。
试剂（特别是S9组分、秋水仙素、固定液）需新鲜配制或按要求保存，确保有效。
显微镜及镜油需保持清洁。
定期进行人员培训和一致性考核，确保阅片标准统一。
建立并维护可靠的试验室历史背景数据和阳性对照数据库。
培养条件（温度、CO2浓度、湿度）需严格监控。
对于难以溶解或高毒性的受试物，应采取特殊处理措施（如过滤除菌、减少暴露浓度/时间），并详实记录。
遵循GLP（良好实验室规范）原则进行试验操作和数据管理（如适用）。

8. 总结

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是评估化学物质遗传毒性的经典、可靠方法。通过直接观察细胞染色体结构的改变，它能灵敏地检测出可引起染色体断裂和重排的诱变剂。规范的试验操作、合理的试验设计、严格的质量控制以及准确的结果解读，对于获得科学可靠的数据、正确评估受试物的遗传毒性风险至关重要。其结果结合其他遗传毒性试验和整体毒理学研究，为化学品的安全性评价提供关键依据。