痤疮丙酸杆菌抑菌试验（化妆品功效性试验）

发布时间：2025-06-24 18:14:28 阅读量：1 作者：生物检测中心

痤疮丙酸杆菌抑菌试验：化妆品功效的科学验证

摘要： 痤疮丙酸杆菌是导致痤疮（俗称“青春痘”）的主要病原微生物之一。评估化妆品（尤其是宣称具有祛痘、控油、改善粉刺等功效的产品）对痤疮丙酸杆菌的抑制能力，是其功效宣称的重要科学依据。本试验依据微生物学标准方法，旨在客观评价化妆品样品对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌效果。

一、 引言 痤疮是一种常见的毛囊皮脂腺慢性炎症性疾病，主要累及面部、胸背部等皮脂腺丰富的区域。痤疮丙酸杆菌作为皮肤常驻菌群的一员，在痤疮发病机制中扮演着关键角色：

  1. 定植与繁殖： 该菌在富含皮脂的厌氧毛囊环境中大量增殖。
  2. 代谢活动： 分解皮脂产生游离脂肪酸和过氧化氢等物质，刺激毛囊壁。
  3. 炎症诱导： 其代谢产物和细胞壁成分可激活宿主免疫反应，导致炎症反应（红、肿、痛），形成炎性丘疹、脓疱甚至结节囊肿。 因此，能够有效抑制痤疮丙酸杆菌生长或杀灭该菌的化妆品成分或配方，被认为是改善和预防痤疮的重要手段之一。本试验通过体外抑菌试验，为评价相关化妆品配方的功效潜力提供实验室数据支持。

二、 试验原理 本试验采用琼脂扩散法（打孔法/牛津杯法） 和/或最低抑菌浓度测定法来评估样品的抑菌效果。

  1. 琼脂扩散法：
    • 将含有一定浓度痤疮丙酸杆菌的菌液均匀涂布于适宜的厌氧固体培养基平板上。
    • 在平板表面打孔或放置无菌牛津杯，向孔/杯内加入定量的待测化妆品样品（通常包括原液或经过适当稀释的溶液）及必要的对照（阴性对照：无菌溶剂如PBS；阳性对照：已知有效的抗菌剂）。
    • 厌氧条件下培养一定时间后，样品中的有效抑菌成分会向周围琼脂中扩散。
    • 若样品具有抑菌作用，在孔/杯周围会形成透明的抑菌圈。测量抑菌圈直径（毫米，mm），其大小通常与样品的抑菌活性呈正相关。
  2. 最低抑菌浓度测定法：
    • 将待测化妆品样品在适宜的液体培养基中进行一系列倍比稀释（如原液、1：2， 1：4， 1：8...）。
    • 在每个稀释度的试管/微孔中加入等量处于对数生长期的痤疮丙酸杆菌菌液。
    • 同时设置菌液对照（不加样品）和培养基对照（不加菌液）。
    • 厌氧条件下培养规定时间后，观察结果。
    • 最低抑菌浓度（MIC） 是指肉眼观察下，能够完全抑制细菌生长的最低样品浓度（或最高稀释倍数）。MIC值越低，表明样品抑制该菌所需浓度越小，抑菌能力越强。

三、 试验材料与方法

  1. 试验菌株：
    • 痤疮丙酸杆菌标准菌株（例如：ATCC 6919, ATCC 11827等），需经复苏、纯化及鉴定确认。
    • 试验前活化，接种于适宜的厌氧琼脂斜面或液体培养基中，于37°C厌氧环境（通常使用厌氧培养罐配合厌氧产气袋）中培养48-72小时。
  2. 培养基：
    • 增菌培养基： 强化梭菌培养基或布氏肉汤（补充氯化血红素和维生素K1）。
    • 琼脂培养基： 强化梭菌琼脂或布氏琼脂（补充氯化血红素和维生素K1），用于琼脂扩散法或制备菌悬液。
    • 液体培养基： 强化梭菌肉汤或布氏肉汤（补充氯化血红素和维生素K1），用于MIC测定。
    • 所有培养基均需高压灭菌并预还原。
  3. 试验样品：
    • 待测化妆品样品（膏霜、乳液、精华液、凝胶、水剂等）。
    • 根据样品性状进行适当处理：
      • 液体或易溶解样品：可直接使用或用无菌溶剂（如PBS或培养基）稀释。
      • 不易溶解样品：需用合适的溶剂（如含少量吐温80的PBS）溶解或稀释，确保有效成分释放，并验证溶剂本身无抑菌性。
    • 样品前处理： 必要时进行无菌过滤除菌（特别是含不溶性物质的样品）。
  4. 中和剂（关键步骤）：
    • 化妆品中常含有防腐剂或其他具有潜在抑菌活性的成分。为了准确评估功效成分（而非防腐剂）对痤疮丙酸杆菌的作用，以及在琼脂扩散法后准确回收菌落计数，必须使用合适的中和剂。
    • 中和剂的种类和浓度需通过预试验验证，确认其能有效中和样品的残留抑菌活性，且自身对细菌生长和培养基无不良影响。常用中和剂包括卵磷脂聚山梨酯80培养基、硫代硫酸钠溶液、组氨酸溶液等或其组合。
  5. 试验分组：
    • 试验组： 待测化妆品样品（不同浓度或不同稀释度）。
    • 阳性对照组： 已知对痤疮丙酸杆菌有效的抗菌药物（如氯霉素、克林霉素等）。
    • 阴性对照组：
      • 琼脂扩散法：加入等量无菌溶剂（如PBS）的孔/杯。
      • MIC法：不含样品的菌液对照（应生长良好）、不含样品和菌液的培养基对照（应澄清无菌）。
    • 中和剂对照组（验证试验）： 验证中和剂有效性。
  6. 试验步骤（以琼脂扩散法为例）：
    1. 制备菌悬液：刮取厌氧培养48-72小时的菌苔，用无菌生理盐水或PBS悬浮，调整菌液浓度至0.5麦氏浊度（约1-3 x 10^8 CFU/mL）。
    2. 涂布接种：取适量菌悬液（如100μL），用无菌涂布棒均匀涂布于预还原的厌氧琼脂平板表面。
    3. 打孔/放置牛津杯：在琼脂表面打孔（直径通常6-8mm）或放置无菌牛津杯。
    4. 加样：向孔/杯内加入等量（如80-100μL）的待测样品溶液（原液或稀释液）、无菌溶剂（阴性对照）、已知抗菌剂溶液（阳性对照）。避免溢出。
    5. 预扩散：将平板正置放置于室温约30-60分钟，使样品在琼脂表面初步扩散。
    6. 厌氧培养：将平板转移至厌氧培养罐中，于37°C厌氧培养48-72小时。
    7. 观察与测量：培养结束后，测量每个孔/杯周围形成的抑菌圈直径（mm），精确至0.1mm或0.5mm。每个样品至少做3个平行，取平均值报告。同时观察菌苔生长是否均匀。
  7. 试验步骤（以MIC测定法为例）：
    1. 制备样品稀释液：在无菌试管/微孔板中，用液体培养基对样品进行连续倍比稀释（如1:1, 1:2, 1:4, ..., 1:256）。
    2. 制备菌悬液：同琼脂扩散法，调整菌液浓度至0.5麦氏浊度，再用培养基稀释100倍（约1-3 x 10^6 CFU/mL）。
    3. 加菌：向每管/每孔含有不同浓度样品的培养基中加入等量（如100μL）稀释好的菌悬液。最终接种量约为5 x 10^5 CFU/mL。
    4. 设置对照：菌对照（培养基+菌悬液）、培养基对照（培养基+无菌水/PBS）、溶剂对照（如有）。
    5. 厌氧培养：将试管/微孔板置于厌氧培养罐中，于37°C厌氧培养48-72小时。
    6. 结果判定：肉眼观察各管/孔的浑浊度。与菌对照管相比，完全澄清无可见生长的最高稀释管（最低浓度）即为该样品的MIC值。
  8. 结果计算与判定：
    • 琼脂扩散法： 报告各组抑菌圈直径（mm）的平均值及标准差。通常会设定一个抑菌圈阈值（例如：≥7mm或≥10mm，需根据实验条件和经验确定）来判断样品是否具有显著的抑菌活性。抑菌圈直径越大，表明抑菌活性越强。
    • MIC法： 报告MIC值（例如：MIC = 1/16， MIC = 3.125 mg/mL等）。MIC值越低，表明抑菌活性越强。结合阳性对照的MIC值，可初步判断样品抑菌活性的强弱。通常认为MIC ≤ 1 mg/mL（或≤ 1%）具有较好的抑菌潜力。
    • 抑菌率计算（可选）： 在MIC法或菌落计数法中，可计算样品的抑菌率。 抑菌率 (%) = [(阴性对照组平均菌落数 - 试验组平均菌落数) / 阴性对照组平均菌落数] × 100% 抑菌率≥50%或≥90%（可根据研究目的设定）通常认为具有显著抑菌效果。

四、 结果报告 试验报告应清晰、完整地包含以下信息：

  1. 试验名称： 痤疮丙酸杆菌抑菌试验报告。
  2. 试验目的： 评价XX样品对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌活性。
  3. 试验依据： 参考《化妆品安全技术规范》或其他相关微生物学检验方法标准（注明标准号/名称）。
  4. 试验菌株： 名称、来源（标准库编号）。
  5. 样品信息： 样品编号、性状、前处理方法、测试浓度/稀释度。
  6. 试验方法： 详细描述所用的方法（琼脂扩散法/MIC法）、培养基、培养条件（温度、时间、厌氧方式）、中和剂信息（如使用）、试验分组设计。
  7. 试验结果：
    • 琼脂扩散法：各试验组、阳性对照、阴性对照的抑菌圈直径（mm）（平均值 ± 标准差），并附清晰的照片。
    • MIC法：各试验组及各对照组的生长情况描述，确定的MIC值。
    • 抑菌率（如计算）。
  8. 结果判定与分析： 根据设定的标准（如抑菌圈直径、MIC值、抑菌率），判定样品是否具有显著的抑菌活性，并讨论其效果强弱。
  9. 试验日期与人员。
  10. 注意事项： 注明体外试验结果仅作为参考，实际功效还需结合人体试验等评估。

五、 讨论与注意事项

  1. 体外与体内差异： 体外抑菌试验结果不能完全等同于产品在人体皮肤上的实际效果。皮肤屏障、pH环境、菌群复杂性、产品配方透皮性等因素都会影响最终功效。
  2. 样品前处理的重要性： 样品的溶解性、均一性、中和剂的选择对结果准确性至关重要。不恰当的处理可能导致假阴性或假阳性结果。
  3. 厌氧条件的控制： 痤疮丙酸杆菌是专性厌氧菌，严格维持厌氧环境（厌氧罐、厌氧袋配合有效产气包）是试验成功的关键。
  4. 菌株活性与浓度： 使用的菌株应处于活跃的对数生长期，接种浓度需标准化，以确保试验条件的稳定性和结果的可比性。
  5. 方法选择： 琼脂扩散法操作相对简便直观，适合初步筛选；MIC法能提供定量的抑菌浓度信息，结果更精确。可根据研究目的和实验室条件选择合适的方法或结合使用。
  6. 阳性对照的意义： 设置有效的阳性对照（抗菌药物）是验证整个试验系统（菌株活性、培养基、操作）是否正常可靠的重要环节。阳性对照预期应显示显著的抑菌效果。
  7. 结果的解释与应用： 该试验主要用于支持产品的功效宣称（如控油抗痘），为配方研发、筛选和优化提供依据，也可用于产品质量控制（如比较不同批次）。最终的宣称需结合人体功效评价试验。

六、 结论 痤疮丙酸杆菌抑菌试验是评估化妆品（特别是宣称祛痘、控油、抗粉刺功效产品）体外抑菌活性的重要标准化方法。通过琼脂扩散法测定抑菌圈直径或通过MIC法确定最低抑菌浓度，可以为产品配方的开发、功效宣称提供客观的实验室数据支持。严格的试验条件控制（尤其是厌氧环境）、规范的样品处理（特别是中和剂的使用）、合理的试验设计以及对结果的谨慎解读，是获得可靠、有意义结果的关键。本试验结果是综合评价化妆品祛痘功效的必要组成部分。

参考文献：

  • 《化妆品安全技术规范》（最新版）
  • CLSI M11-A8: Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria
  • Microbiology Laboratory Manuals (e.g., references describing standard broth microdilution and agar diffusion methods for anaerobes)
  • Relevant scientific publications on Cutibacterium acnes and antimicrobial testing.