体外促创面愈合试验（化妆品体外功效性试验）

发布时间：2025-06-24 18:05:56 阅读量：4 作者：生物检测中心

体外促创面愈合试验：化妆品功效的科学评估基石

摘要： 体外促创面愈合试验是化妆品功效评价体系的重要组成部分，通过模拟皮肤创面愈合的关键环节，在细胞与分子层面客观评估产品促进组织修复的潜能。本试验为化妆品宣称“促进伤口愈合”、“修复皮肤屏障”等功效提供科学依据，是产品研发、质量控制及合规宣称的关键环节。

一、 引言

皮肤创面愈合是一个高度协调、动态的生物学过程，涉及炎症反应、细胞增殖与迁移、组织重塑等多个阶段。化妆品，特别是宣称具有修复、再生功效的产品（如精华、修护霜等），其核心作用机制往往在于调节这些愈合过程中的关键环节。体外促创面愈合试验利用标准化的细胞模型和创面模拟体系，在受控环境中量化测试产品对关键细胞行为（如增殖、迁移）及愈合相关生物标志物的影响，为功效宣称提供体外实验数据支持。

二、 试验原理

该试验的核心原理是在体外建立模拟皮肤创面的模型，通过特定的损伤方式（如机械划痕、化学刺激等）在单层或三维（3D）培养的皮肤细胞（主要是角质形成细胞和成纤维细胞）上制造可控的“创口”。将待测化妆品样品（或其活性成分提取物）作用于该模型后，系统监测并量化以下关键指标随时间的变化：

  1. 细胞迁移能力： 细胞向“创口”中心迁移覆盖的速度和范围，反映上皮化进程。
  2. 细胞增殖活性： “创口”边缘及周边区域的细胞增殖速率，反映组织再生能力。
  3. 关键生物标志物表达： 愈合相关因子（如TGF-β, VEGF, EGF, Collagen I/III, Fibronectin等）在基因转录（qPCR）或蛋白分泌（ELISA, Western Blot）水平的变化。
  4. (可选)细胞外基质合成： 对成纤维细胞合成胶原蛋白、弹性蛋白等胞外基质成分的促进作用。

三、 核心试验方法

  1. 细胞模型选择：

    • 角质形成细胞： 常用人永生化角质形成细胞系（如HaCaT）或原代正常人表皮角质形成细胞（NHEK）。负责创面再上皮化。
    • 成纤维细胞： 常用人真皮成纤维细胞（HDF）。负责合成胞外基质，促进真皮重建。
    • 共培养模型： 将角质形成细胞与成纤维细胞共培养，更接近皮肤生理状态，评估细胞间相互作用。
    • 3D皮肤模型： 重建的表皮模型（EpiSkin®, EpiDerm™等）或全层皮肤模型（包含表皮和真皮），结构更复杂，可进行更真实的划痕或物理损伤试验。

  2. 创面模型建立（划痕试验为例）：

    • 细胞接种于培养板（如6孔板、24孔板或专用的细胞培养插件），培养至形成致密单层。
    • 使用无菌枪头、细胞刮刀或专门设计的划痕工具，在细胞单层上制造宽度均一、笔直的“划痕”（模拟创口）。
    • 用PBS轻柔冲洗去除划痕产生的细胞碎片。
    • 更换为含有不同浓度待测样品的培养液（通常设置空白对照、溶剂对照、阳性对照）。

  3. 样品处理与培养：

    • 将待测化妆品样品溶解或稀释于合适的培养基或缓冲液中（需考虑溶解度、稳定性及对细胞无毒性），设置多个浓度梯度。
    • 将含有样品的培养基加入已制造划痕的孔中。
    • 培养箱（37°C, 5% CO2）中继续培养，定期在显微镜下观察并拍照记录（通常于0h, 6h, 12h, 24h, 48h等时间点）。

  4. 结果观测与定量分析：

    • 细胞迁移（划痕闭合率）：
      • 显微镜下拍摄各时间点划痕区域的明场或相差图像。
      • 使用图像分析软件（如ImageJ）测量划痕的宽度或计算划痕区域的剩余面积/已闭合面积。
      • 计算划痕闭合率(%) = [(初始划痕面积 - T时间点划痕面积) / 初始划痕面积] × 100%。
      • 绘制不同处理组划痕闭合率随时间变化的曲线，比较样品组与对照组的差异。
    • 细胞增殖（MTT/CCK-8法）：
      • 在划痕试验结束后或单独进行的增殖试验中，加入MTT或CCK-8试剂。
      • 孵育后，检测生成的甲瓒（MTT法）或水溶性甲臜（CCK-8法）在特定波长下的吸光度（OD值）。
      • OD值与活细胞数量成正比，计算细胞增殖率(%) = [(样品组OD - 空白OD) / (对照组OD - 空白OD)] × 100%。
    • 基因表达（qRT-PCR）：
      • 收集处理后的细胞，提取总RNA。
      • 逆转录合成cDNA。
      • 使用特异性引物进行实时荧光定量PCR，检测目标基因（如Collagen I, Collagen III, Fibronectin, TGF-β1, VEGF等）的mRNA表达水平。
      • 通过2-ΔΔCt法计算目标基因相对于内参基因（如GAPDH, β-actin）的表达变化倍数。
    • 蛋白表达与分泌（ELISA/Western Blot）：
      • ELISA： 收集细胞培养上清液，使用商品化ELISA试剂盒定量检测特定细胞因子（如TGF-β1, VEGF, IL-6等）的分泌水平。
      • Western Blot： 收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗/二抗孵育、显影，检测胞内特定蛋白（如Collagen I, α-SMA等）的表达水平。

四、 结果评价与意义

  • 促迁移作用： 样品组的划痕闭合速率显著快于对照组（尤其是溶剂对照），表明其能有效促进角质形成细胞迁移，加速创面再上皮化。
  • 促增殖作用： 样品组的细胞增殖率显著高于对照组，表明其能刺激创缘细胞增殖，为组织修复提供更多细胞来源。
  • 调控生物标志物： 样品组能显著上调促愈合因子（TGF-β, VEGF, Collagen等）的表达/分泌，或下调抑制愈合的因子，从分子机制层面解释其促愈功效。
  • 综合结论： 结合迁移、增殖及分子标志物数据，可综合评价待测化妆品样品是否具有体外促创面愈合活性，并初步探讨其可能的作用机制（如促进上皮化、刺激胶原合成、调节炎症等），为产品功效宣称提供关键的科学支撑。

五、 适用范围与优势

  • 适用范围： 适用于宣称具有修复、再生、舒缓（针对微损伤）、促进伤口愈合（针对微小创面）、强韧皮肤屏障等功效的化妆品（如精华液、修护霜、面膜、冻干粉等）及其原料的功效筛选和评价。
  • 主要优势：
    • 高通量筛选： 可快速平行测试多个样品或浓度，适用于原料筛选和配方优化。
    • 机制探索： 可深入探究产品在细胞和分子水平的作用机制。
    • 标准化与可控性： 试验条件高度可控，减少个体差异和伦理限制（相比动物和人体试验）。
    • 成本较低： 相对于复杂的体内和临床研究，成本显著降低。
    • 符合伦理要求： 是动物试验替代方法的重要组成部分。

六、 局限性与注意事项

  • 体外局限性： 体外模型无法完全模拟体内复杂的微环境（如神经、血管、免疫系统、微生物群等）以及皮肤完整的屏障结构和力学特性。
  • 模型简化： 划痕模型相对简单，与真实的临床创口存在差异。3D模型更优但成本高。
  • 样品处理： 需确保化妆品样品在培养基中的溶解性、稳定性及无细胞毒性。需设置合适的溶剂对照排除干扰。
  • 结果外推： 体外阳性结果仅为产品具有促愈潜能的初步证据，不能直接等同于人体使用功效。 需结合体内试验（如动物皮肤创伤模型）和/或人体功效评价试验（如皮肤生物物理学测试、视觉评估、角质层取样分析等）进行综合验证。
  • 标准化： 不同实验室在细胞系、划痕方法、检测时间点、数据分析方法上可能存在差异，需尽量遵循相关指南（如ISO, GB/T）或建立严格的内部SOP以保证结果可靠性和可比性。

七、 结论

体外促创面愈合试验是化妆品体外功效评价体系中不可或缺的一环。它通过模拟关键愈合事件，在细胞水平提供客观、量化的数据，科学评估化妆品促进皮肤修复与再生的潜能。该试验为产品的研发创新、功效宣称的科学支撑及质量控制提供了重要依据。然而，必须清醒认识到其体外模型的局限性，体外结果需作为综合证据链的一部分，与更接近人体实际情况的体内或临床数据相结合，才能全面、可靠地证实化妆品的宣称功效。严谨、规范的体外促创面愈合试验，是构建化妆品全链条功效评价体系、提升产品科学内涵和消费者信任度的坚实基础。

（注： 本文旨在提供通用性的技术概述，具体试验方案需根据产品特性、宣称重点及实验室条件进行设计和优化。进行化妆品功效宣称备案时，应遵循国家药品监督管理局（NMPA）发布的相关法规和技术要求。）