多肽、蛋白制备与分析

多肽与蛋白质制备与分析技术综述

多肽与蛋白质作为生命活动的核心执行者，其研究对于理解生命机制、疾病机理及新药开发至关重要。以下系统阐述其制备与分析的完整技术路线：

一、多肽与蛋白质制备

1. 多肽制备

• 化学合成法 (主流方法)：
  • 固相肽合成 (SPPS)： 在固相载体上逐步添加氨基酸，包括Fmoc（9-芴甲氧羰基）与Boc（叔丁氧羰基）两种策略。核心步骤：脱保护、活化偶联、洗涤、重复循环。优势：自动化程度高，适合合成<50个氨基酸的多肽，可引入非天然氨基酸及修饰。
  • 液相肽合成 (LPPS)： 在溶液中进行片段缩合，适用于合成中等长度或特殊序列多肽。需精确控制反应条件和纯化步骤。
• 生物表达法 (重组DNA技术)：
  • 将目标多肽基因克隆入表达载体（质粒），在宿主细胞（大肠杆菌、酵母等）中表达为融合蛋白。
  • 通过酶切或化学裂解从融合蛋白中释放目标多肽。
  • 优势：成本效益高，适合较长多肽或含复杂修饰的多肽（需特定宿主），但需考虑蛋白酶降解风险。
• 酶解法：
  • 利用特定蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）降解天然蛋白质，分离纯化目标多肽片段。
  • 主要用于获取特定功能片段或结构研究。

2. 蛋白质制备

• 重组表达技术 (主流方法)：
  • 宿主系统：
    • 原核系统（大肠杆菌）： 操作简便、成本低、周期短、表达量高，适合可溶性蛋白或无复杂修饰蛋白。挑战：包涵体形成、缺乏真核修饰（糖基化、磷酸化）。
    • 真核系统：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞：
      • 酵母： 生长快、成本较低，可进行部分糖基化（过度甘露糖化）。
      • 昆虫细胞： 利用杆状病毒表达系统，可进行更接近哺乳动物的复杂翻译后修饰。规模化挑战大。
      • 哺乳动物细胞： 能实现最准确的翻译后修饰（糖型、折叠），是治疗性抗体及复杂蛋白首选。成本高、周期长、技术复杂。
  • 表达策略：
    • 胞内表达： 可溶性表达或形成包涵体。
    • 分泌表达： 将蛋白分泌到培养基中，利于纯化且减少胞内蛋白酶降解，需融合信号肽。
  • 瞬时转染 vs 稳定细胞系： 瞬时用于快速小量制备；稳定细胞系用于长期、规模化生产。
• 天然来源提取：
  • 从动植物组织或体液中分离纯化天然存在的蛋白质。
  • 关键挑战：起始材料有限、杂质复杂、纯化难度高、批次间差异大。主要用于研究特定天然蛋白或难以重组表达的蛋白。

二、分离与纯化

• 初始捕获：
  • 离心/过滤： 去除细胞碎片、大的颗粒物。
  • 沉淀： 硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀等，粗分离浓缩目标物。
• 色谱层析技术 (核心手段)：
  • 亲和层析： 利用生物特异性相互作用（抗原-抗体、配体-受体、标签-配体如His-tag/Ni-NTA、GST-tag/谷胱甘肽）实现高选择性捕获。纯度高、速度快，常作为第一步。
  • 离子交换层析： 根据分子表面电荷差异进行分离（阳离子交换、阴离子交换）。分辨率高，载量大，常用于中间纯化。
  • 疏水作用层析： 利用分子表面疏水性差异分离。在高盐浓度下结合，低盐洗脱。适合分离疏水性差异大的蛋白。
  • 尺寸排阻层析： 根据分子大小（斯托克斯半径）分离。用于脱盐、缓冲液置换、精细纯化去除聚集体。
  • 反相色谱： 基于分子疏水性差异，使用有机溶剂梯度洗脱。分辨率极高，是多肽纯化的主要最终步骤，也用于蛋白质（尤其疏水性蛋白）。
• 策略： 通常采用多步层析组合（如：亲和捕获 → 离子交换 → 分子筛），逐步提高纯度。工艺需针对目标分子特性优化。

三、分析与表征

1. 理化性质分析

• 纯度分析：
  • 高效液相色谱： 反相色谱（RP-HPLC）是多肽纯度金标准，色谱峰面积百分比评估纯度。
  • 毛细管电泳： 分离效率高，样本消耗少，基于电荷/大小分离，是HPLC的重要补充。
  • 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳： 快速评估蛋白质纯度、分子量大小及完整性（单体、聚集体、降解片段）。
• 分子量测定：
  • 质谱：
    • 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱： 快速、准确测定完整蛋白/多肽分子量，常用于肽图确认。
    • 电喷雾电离质谱： 可测定完整分子量、亚基分子量、肽图精确质量数，常与液相色谱联用。
• 氨基酸组成分析：
  • 酸水解后进行氨基酸分析（柱前/柱后衍生化）。
• 序列确认：
  • N端测序： Edman降解法（适用于未封闭N端）。
  • 肽图谱： 特定蛋白酶水解后，利用RP-HPLC-MS/MS分析肽段混合物，将实验图谱与理论序列预测图谱比对，是重组蛋白鉴定的核心方法。
  • 从头测序： 利用高精度串联质谱直接解析多肽或蛋白酶解肽段的氨基酸序列。

2. 高级结构分析

• 二级结构：
  • 圆二色谱： 测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量（α-螺旋、β-折叠、转角、无规卷曲）。
  • 傅里叶变换红外光谱： 通过酰胺I带分析二级结构。
• 三级结构：
  • 核磁共振： 在溶液状态下提供原子分辨率的三维结构信息，适用于小至中等大小的蛋白质。
  • X射线晶体衍射： 提供高分辨率（原子级）的静态三维结构信息，蛋白质需结晶。
  • 冷冻电子显微镜： 无需结晶，可解析接近生理状态的大分子复合物及膜蛋白的高分辨率结构（近原子级），近年发展迅猛。
  • 荧光光谱： 利用内源（色氨酸）或外源荧光探针研究构象变化、折叠/去折叠、分子间相互作用。
• 聚集状态分析：
  • 尺寸排阻色谱： 分析单体和可溶性聚集体。
  • 动态光散射： 快速测定溶液中分子的流体力学半径及分布（粒径大小）。
  • 静态光散射： 结合色谱联用，精确测定绝对分子量及聚集状态。
  • 分析型超速离心： 基于沉降行为分析溶液中分子的聚集状态、均一性、相互作用（溶液状态“金标准”）。

3. 生物活性与功能分析

• 体外活性测定： 酶活力测定、受体结合实验、细胞增殖/抑制实验、抗菌活性测定等。
• 免疫学分析： 酶联免疫吸附测定（定量检测）、免疫印迹（定性及半定量检测）。

4. 稳定性研究

• 物理稳定性： 聚集、沉淀、吸附现象研究。
• 化学稳定性： 脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配等降解途径考察。
• 方法： 加速稳定性试验（高温、光照、振荡）、强制降解试验、长期稳定性监测，结合多种分析手段评估降解途径和速度。

四、应用与展望

• 基础研究： 解析蛋白质结构功能、信号通路、酶学机制。
• 药物开发： 多肽药物（激素、抗菌肽、抗癌肽）、治疗性蛋白质（抗体、细胞因子、酶替代疗法、疫苗）。
• 诊断试剂： 抗原、抗体、酶标记物。
• 生物材料： 生物相容性材料（胶原蛋白、丝素蛋白）。
• 工业酶制剂： 洗涤剂、食品加工、生物催化。
• 趋势： 新型表达系统开发（无细胞表达）、连续生产工艺、更灵敏高分辨的分析技术（质谱技术演进、冷冻电镜普及）、人工智能在结构预测/工艺开发中的应用、复杂修饰蛋白（如糖蛋白）的精确分析与生产控制。

总结

多肽与蛋白质的制备与分析是一个高度复杂且不断发展的技术体系。从精确的化学合成或高效的生物表达出发，通过多步精细的分离纯化获得高纯度产物，进而运用多种互补的分析技术全面表征其理化性质、高级结构与生物功能，并评估其稳定性。这些技术的持续进步为生命科学基础研究的深入和生物医药产业的发展提供了强大的支撑。严谨、系统、多维度的方法是确保研究结果可靠性和产品质量的关键。