还原型抗坏血酸（AsA）/维生素C含量测定

发布时间：2025-06-24 10:53:46 阅读量：8 作者：生物检测中心
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还原型抗坏血酸（AsA）/维生素C含量测定方法详解

一、引言 还原型抗坏血酸（Ascorbic Acid, AsA），即维生素C，是维持人体健康不可或缺的水溶性维生素，具有抗氧化、促进胶原蛋白合成、增强免疫力等生理功能。准确测定食品、药品及生物样品中的维生素C含量，对品质控制、营养评估及研究具有重要意义。本文详述三种常用测定方法。

二、测定原理与方法 注：以下方法均需使用分析纯试剂，实验用水为蒸馏水或去离子水。

方法一：碘量法（氧化还原滴定法） 原理： 维生素C具有强还原性，可定量还原碘（I₂）生成碘离子（I⁻），以淀粉为指示剂，溶液蓝色消失为终点。 C₆H₈O₆ + I₂ → C₆H₆O₆ + 2I⁻ + 2H⁺

试剂：

  1. 碘标准溶液（0.05 mol/L）：精确称取碘化钾20g溶于30mL水，加入6.5g碘，溶解后定容至500mL，棕色瓶避光保存。
  2. 淀粉指示剂（1%）：1g可溶性淀粉加少量水调浆，倒入100mL沸水，煮沸至透明。
  3. 草酸溶液（2%）：20g草酸溶于1L水。

操作步骤：

  1. 样品处理： 称取匀浆样品10g → 加2%草酸溶液50mL → 振荡提取30min → 滤纸过滤 → 滤液备用（深色样品需加活性炭脱色）。
  2. 滴定： 取滤液20mL于锥形瓶 → 加淀粉指示剂1mL → 用碘标准溶液滴定至蓝色30秒不褪色。
  3. 空白： 用等量草酸溶液代替样品液，同法滴定。

计算： 维生素C含量 (mg/100g) = [(V - V₀) × C × M × 100] / (m × V₁) V：样品滴定体积 (mL)，V₀：空白滴定体积 (mL)，C：碘液浓度 (mol/L) M：维生素C分子量（176.12 g/mol），m：样品质量 (g)，V₁：滴定用样液体积 (mL)

方法二：2,6-二氯靛酚滴定法（染料滴定法） 原理： 蓝色染料2,6-二氯靛酚可被维生素C还原为无色，终点由蓝色变粉红色。 试剂：

  1. 2,6-二氯靛酚钠盐溶液：50mg染料溶于含42mg NaHCO₃的150mL热水中 → 定容至250mL → 滤纸过滤 → 棕色瓶4℃保存（每周标定）。
  2. 维生素C标准液（1mg/mL）：50mg维生素C溶于2%草酸 → 定容至50mL（现配现用）。

操作步骤：

  1. 染料标定： 取5mL维生素C标准液 → 加5mL 2%草酸 → 用染料液快速滴定至粉红色（15秒不褪）。 染料滴定度 (T) = 5 / V (mg/mL)，V为消耗染料体积 (mL)。
  2. 样品测定： 取滤液5mL（同碘量法处理）→ 加5mL 2%草酸 → 用染料滴定至粉红色。

计算： 维生素C含量 (mg/100g) = (V × T × 100) / (m × V₁) V：样品消耗染料体积 (mL)，T：染料滴定度 (mg/mL)，m：样品质量 (g)，V₁：滴定用样液体积 (mL)

方法三：高效液相色谱法（HPLC） 原理： 样品经提取后，通过反相色谱柱分离，紫外检测器定量分析。 条件参考：

  • 色谱柱： C18柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）
  • 流动相： 0.1%磷酸水溶液 : 甲醇 = 95 : 5 (v/v)
  • 流速： 1.0 mL/min
  • 检测波长： 245 nm
  • 柱温： 30℃
  • 进样量： 10 μL

操作步骤：

  1. 样品前处理： 样品加2%偏磷酸提取 → 涡旋 → 离心（10000 × g, 10min）→ 上清液过0.45μm滤膜。
  2. 测定： 绘制维生素C标准曲线 → 注入样品液 → 根据保留时间定性，峰面积定量。

三、注意事项

  1. 防氧化： 所有操作需避光快速完成，提取剂（草酸、偏磷酸）可抑制维生素C氧化。
  2. 干扰排除：
    • 碘量法受其他还原物干扰（如Fe²⁺、SO₃²⁻），果蔬样品误差约5-10%。
    • HPLC法特异性高，需注意调整流动相pH避免维生素C峰拖尾。
  3. 方法选择：
    • 碘量法： 设备简单，适合高含量样品（如水果）。
    • 染料法： 操作便捷，适用于浅色样品。
    • HPLC法： 灵敏度高（检出限约0.1mg/kg），抗干扰强，适合复杂基质。

四、适用样品范围

五、参考文献

  1. 国家标准《GB 5009.86-2016 食品中抗坏血酸的测定》
  2. AOAC Official Method 967.21 (Vitamin C in Foods)
  3. Journal of Chromatography B (2011), "Simultaneous determination of ascorbic acid and dehydroascorbic acid by HPLC"

关键提示：

  1. 若样品含DHA（脱氢抗坏血酸），需先用还原剂（如二硫苏糖醇）将其转化为AsA再测定。
  2. 使用碘量法时，滴定速度需快，避免维生素C被空气氧化。
  3. HPLC分析中，流动相添加0.1 mmol/L EDTA可络合金属离子，保护维生素C稳定性。

本方法适用于科研、质检及生产控制领域，通过规范操作可获得可靠数据。实际应用中需根据样品特性及实验室条件选择合适方法，并严格进行空白对照和重复试验。