lc-ms测分子量

LC-MS测定分子量：原理与实践详解

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）已成为现代分析化学中测定化合物分子量不可或缺的核心工具。其结合了液相色谱（LC）的高效分离能力和质谱（MS）强大的结构鉴定能力，为复杂基质中的目标物分析提供了强有力的支持。

一、核心原理：分子量与质荷比（m/z）

质谱法的核心在于测量离子化后气相离子的质荷比（m/z）。

• 离子化过程： 样品分子通过离子源（如ESI、APCI）转化为带电离子（如 [M+H]⁺、[M-H]⁻、[M+Na]⁺ 等）。
• 关键关系： 对于带单个电荷的离子（如 [M+H]⁺），其质荷比 m/z ≈ 分子量 (MW) + 1（或 -1）。因此，测得该离子的m/z值，减去（或加上）质子（或其它加合物）的质量，即可获得该化合物的精确分子量。
• 高分辨率质谱（HRMS）： 现代HRMS（如TOF、Orbitrap、FT-ICR）可提供极高的质量精度（通常优于5 ppm甚至1 ppm），不仅能给出精确分子量，还能用于推测分子式。

二、质谱类型选择

• 低分辨率质谱（如单四极杆）： 主要用于初步分子量确认（单位质量精度），适用于已知化合物纯度较高的样品。优势是成本较低、操作相对简单。
• 高分辨率质谱（如飞行时间TOF、轨道阱Orbitrap、傅里叶变换离子回旋共振FT-ICR）： 分子量测定首选。可提供精确分子量（精确到小数点后4位以上）及同位素峰形信息，是鉴定未知物、区分同分异构体（需结合MS/MS或色谱）及确认分子式的关键。

三、LC-MS测定分子量的典型流程

1. 样品制备：

   • 目标：获得纯净、浓度适中的溶液，去除干扰基质。
   • 方法：溶解（水、甲醇、乙腈等）、稀释、过滤（去除颗粒）、萃取（液液萃取、固相萃取）、沉淀蛋白（生物样品）。
   • 关键：避免引入盐分、表面活性剂、高分子聚合物等高浓度干扰物，防止离子抑制。

2. 液相色谱分离：

   • 目的：在样品进入质谱前进行分离，减少基质效应和离子抑制，提高质谱信号质量和准确性。常用反相色谱柱（如C18）。
   • 优化：流动相（通常含挥发性缓冲盐如甲酸铵、乙酸铵及酸/碱调节剂如甲酸、氨水）、梯度洗脱程序需根据化合物性质优化以确保良好分离度和峰形。

3. 离子源选择与优化：

   • 电喷雾离子化： 最常用，适用于极性化合物、大分子（蛋白质、多肽）及热不稳定化合物。易形成多电荷离子（适用于大分子MW测定）和加合离子（[M+H]⁺、[M+Na]⁺、[M+NH₄]⁺、[M-H]⁻等）。
   • 大气压化学电离： 适用于弱极性、小分子化合物，主要产生 [M+H]⁺ 或 [M-H]⁻。
   • 优化参数： 喷雾电压、雾化气压力/流量、干燥气温度/流量、毛细管温度（ESI）、蒸发器温度（APCI）、鞘气/辅助气流量等。目标是获得目标物最强的单电荷或特征加合离子信号，并尽量减少干扰。

4. 质谱条件设置：

   • 扫描模式： 通常采用全扫描模式（如Full Scan、MS¹），检测一定m/z范围内的所有离子。
   • 质量范围： 根据预估分子量设定。
   • 分辨率： 高分辨质谱需选择合适的分辨率设置（权衡灵敏度和分辨率）。
   • 校准： 至关重要！ 实验前必须使用标准校正液（含一系列已知精确质量化合物）对质谱进行质量轴校准，确保m/z测定的准确性。

5. 数据采集与分析：

   • 采集目标化合物色谱峰对应的质谱图。
   • 识别目标离子峰： 在质谱图中找到代表目标分子的离子峰（通常是基峰或强峰）。常见的有：
     • [M+H]⁺ (正离子模式)
     • [M-H]⁻ (负离子模式)
     • 其它加合离子：[M+Na]⁺, [M+K]⁺, [M+NH₄]⁺, [M+Acetate]⁻ 等。
   • 观察同位素峰簇： 高分辨质谱可清晰展现符合化合物元素组成（主要是C、H、N、O、S、Cl、Br等）特征的同位素峰分布（如M、M+1、M+2峰的相对丰度），这是验证分子量和推测分子式的重要依据。
   • 计算分子量：
     • 情况1：清晰的主离子峰（如 [M+H]⁺）: MW = 测得主离子m/z值 - 1.0078 (H⁺质量)。
     • 情况2：加合离子峰（如 [M+Na]⁺）: MW = 测得加合离子m/z值 - 22.9898 (Na⁺质量)。
     • 情况3：多电荷离子（常见于大分子）: 如测得 [M+2H]²⁺ 的 m/z 值为 Z，则 MW = 2 * (Z - 1.0078)。软件通常能自动识别电荷状态并计算分子量。
   • 利用高精度质量计算分子式： 对于高分辨数据，软件可根据测得的精确m/z值（如 [M+H]⁺ = 283.1446）和质量精度要求（如 5 ppm），计算可能的元素组成（分子式）。

四、关键注意事项与技巧

• 加合离子的识别： 加合离子的存在是常态而非例外。结合正负离子模式切换、调整溶剂/添加剂（如减少钠盐）、观察同位素峰形有助于识别真正的 [M+H]⁺ 或 [M-H]⁻。软件通常提供加合物列表辅助识别。
• 基质效应与离子抑制/增强： 复杂基质中的共存物可能显著抑制或增强目标物的离子化效率，导致信号失真甚至检测不到。良好的色谱分离、样品前处理、基质匹配的标准曲线或使用同位素内标是克服基质效应的关键。
• 溶剂和添加剂： 使用高纯度、挥发性溶剂（乙腈、甲醇、水）和添加剂（甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵）。避免使用磷酸盐、硫酸盐、三氟乙酸（除非必要且注意浓度）、离子对试剂、表面活性剂、不挥发性缓冲盐等。
• 仪器状态与维护： 保持离子源、质量分析器的清洁，定期进行调谐和质量校准，是获得可靠数据的基础。
• 数据质量评估：
  • 信噪比（S/N）： 目标峰信号应显著高于背景噪声。
  • 质量精度： 高分辨质谱测得的m/z值与理论值（如有）或内标校准物的偏差应在仪器标称精度范围内（如 < 5 ppm）。
  • 同位素分布匹配度： 对于高分辨数据，实测同位素峰簇的相对丰度应与基于推测分子式计算的理论分布相匹配（常用软件计算匹配度）。

五、总结

LC-MS凭借其高灵敏度、高选择性以及精确测定分子量的能力，在药物研发、代谢组学、环境分析、食品安全、法医毒物学等诸多领域发挥着核心作用。掌握LC-MS测定分子量的原理、流程及关键注意事项，是成功进行化合物鉴定和结构解析的基础。理解质荷比（m/z）与分子量的关系、熟悉常见离子化模式和加合离子现象、保证仪器状态良好、优化样品前处理与色谱质谱条件、严谨分析数据（特别是高分辨质谱的同位素信息和质量精度），是获得可靠分子量信息的关键要素。

通过遵循上述原则与实践经验，研究者可以高效、准确地利用LC-MS技术获取目标化合物的分子量信息，为深入研究其化学性质与结构奠定坚实基础。