胆碱类（乙酰胆碱，acetylcholineAch）检测 - 中析研究所生物检测中心

乙酰胆碱（ACh）检测：原理、方法与应用

乙酰胆碱（ACh）作为生命活动中至关重要的神经递质和局部调节因子，其精准检测对理解神经生理机制、疾病诊断及药物研发具有核心价值。以下是对ACh检测技术的系统阐述：

一、 ACh的生物学重要性

核心神经递质： 中枢神经系统（学习记忆、觉醒）、外周神经系统（神经肌肉接头激活骨骼肌、自主神经节传递）的关键信使。
局部调节因子： 在非神经组织（如上皮、内皮、免疫细胞）中参与信号调控。
疾病关联： 阿尔茨海默病（中枢胆碱能神经元退化）、重症肌无力（神经肌肉接头ACh受体自身免疫）、自主神经功能障碍等疾病的核心病理环节。

二、 ACh检测的主要挑战

化学特性： 分子量小（146.21 Da）、无特征发色团/荧光基团，难以直接光学检测。
高水解速率： 乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）在体内外迅速将其水解为胆碱和乙酸。
低浓度： 生物样本中浓度极低（脑组织间隙液：nM级别；血液：pM级别）。
复杂基质干扰： 生物样本中含有大量结构类似物（如胆碱）及其他干扰物质。

三、主要检测方法与技术

1. 基于生物传感器/酶联法

* **原理：** 利用AChE水解ACh产生胆碱和乙酸，胆碱再被胆碱氧化酶（ChOx）氧化产生过氧化氢（H₂O₂）。检测H₂O₂（电化学法、比色法、化学发光法）间接定量ACh。 * **特点：** * **优势：** 相对简单、成本较低、可微型化（如酶电极生物传感器），适用于实时、在线监测（如微透析系统）。 * **局限：** 特异性依赖酶（易受胆碱等干扰），灵敏度相对较低（μM级别），需优化防止酶抑制剂干扰，无法区分ACh类似物。

2. 液相色谱分离结合检测技术

* **原理：** 高效液相色谱（HPLC）或超高效液相色谱（UPLC）预先分离样品中的ACh及其他成分，克服基质干扰，再联用高灵敏度检测器。 * **联用检测器：** * **电化学检测器（ECD）：** * 基于上述酶柱（固定化AChE和ChOx）反应生成H₂O₂进行检测。 * 灵敏度较高（可达pM级别），选择性好（经色谱分离），是常用可靠方法。需专用酶柱。 * **质谱检测器（MS），尤其是串联质谱（LC-MS/MS）：** * **原理：** HPLC/UPLC分离后，ACh分子在离子源电离（常为电喷雾正离子化ESI+），通过质荷比（m/z）筛选母离子（ACh [M]+ m/z 146），碰撞诱导解离（CID）产生特征子离子（如m/z 87，胆碱碎片），特异性检测。 * **特点：** **金标准方法**。特异性最高（基于分子质量和碎片指纹），灵敏度极高（可达fM级别），无需酶反应，可同时检测胆碱及其他相关代谢物。设备昂贵，操作复杂，需专业技术人员。 * **荧光检测器（FLD）：** 需衍生化步骤（如与萘-2,3-二甲醛反应生成荧光衍生物），操作较繁琐，灵敏度在衍生化效率和稳定性影响下波动较大，应用不如ECD和MS广泛。

3. 体内微透析结合离线分析

* **原理：** 将微透析探针植入特定脑区或外周组织，持续灌流生理溶液，通过半透膜捕获细胞外液中的ACh，收集透析液。 * **后续分析：** 透析液中ACh浓度极低且含生理盐分，必须使用超高灵敏度的检测技术（**LC-MS/MS是首选**，其次是高效LC-ECD）。 * **特点：** 提供近乎实时的**体内原位**神经化学动态变化信息，解析特定脑区功能。空间分辨率有限，技术难度大，需严格控制回收率。

4. 放射性标记法（历史方法）

* **原理：** 使用放射性同位素（如³H或¹⁴C）标记的胆碱前体孵育组织或细胞，新合成的ACh即带有放射性标记，分离后通过测定放射性强度定量。 * **特点：** 灵敏度高，曾用于研究合成与释放动力学。操作复杂，涉及放射性危害，特异性问题（标记的是含胆碱分子池），已逐渐被非放射性高灵敏方法取代。