碳水化合物检测

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

碳水化合物检测：方法与技术概述

碳水化合物作为生命体主要的能量来源和重要的结构物质，广泛存在于各类食品、农产品、生物样品及环境基质中。准确检测其含量与组成，对营养评估、质量控制、工艺开发及科学研究至关重要。以下系统介绍当前主要的碳水化合物检测方法：

一、 传统化学法

这些方法通常基于碳水化合物与特定试剂反应产生可测量的颜色变化或沉淀。

  1. 还原糖测定法：

    • 斐林试剂法 (Fehling's Test) / 兰-艾农法 (Lane-Eynon Method): 基于还原糖（如葡萄糖、果糖、麦芽糖）在碱性条件下将铜离子(Cu²⁺)还原为氧化亚铜(Cu₂O)沉淀。通过测定消耗的铜离子量（滴定终点或比色法测定沉淀量）来定量还原糖。
    • 3,5-二硝基水杨酸法 (DNS法)： 还原糖在碱性条件下将3,5-二硝基水杨酸(DNS)中的硝基还原为氨基，生成橙红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，在540nm左右有特征吸收峰，通过比色法定量。快速简便，常用于酶活测定。
    • 伯川法 (Bertrand Method)： 还原糖还原斐林试剂生成Cu₂O后，Cu₂O溶解在硫酸铁铵溶液中，将Fe³⁺还原为Fe²⁺，再用高锰酸钾滴定Fe²⁺，间接定量还原糖。准确度高，步骤繁琐。

  2. 总糖测定法：

    • 酸水解法 + 还原糖测定： 对于非还原性寡糖和多糖（如蔗糖、淀粉），需先用强酸（如盐酸、硫酸）在一定条件下将其水解成单糖（主要是葡萄糖），然后选用上述还原糖测定方法（通常是DNS法或斐林试剂法）定量水解后的总还原糖，再折算回原样品的总糖含量。水解条件是关键。
    • 蒽酮-硫酸法 (Anthrone Method)： 碳水化合物（尤其是己糖和寡糖、多糖）在浓硫酸作用下脱水生成糠醛或其衍生物，后者与蒽酮反应生成蓝绿色络合物，在620-630nm处有最大吸收。操作简便快速，灵敏度高，常用于植物组织或食品中总可溶性糖的测定。对不同类型的糖显色强度有差异。

  3. 特定糖测定（碘量法 - 淀粉）：

    • 淀粉含量测定： 淀粉遇碘形成蓝色络合物（直链淀粉）或红紫色络合物（支链淀粉）。可以通过比色法测定吸光度进行半定量或间接定量。更准确的方法是将淀粉酶解成麦芽糖或葡萄糖后，再用还原糖法定量。

二、 仪器分析法

这些方法利用现代分析仪器的高分离能力和灵敏度，能同时定性和定量多种碳水化合物。

  1. 色谱法 (Chromatography):

    • 高效液相色谱法 (HPLC)：
      • 配备示差折光检测器 (RID)： 通用型检测器，无需衍生化，操作简单。灵敏度相对较低，受环境温度和流动相组成影响较大，梯度洗脱困难。适用于常量分析。
      • 配备蒸发光散射检测器 (ELSD)： 通用型检测器，响应与物质质量相关，不受溶剂峰干扰，适用于梯度洗脱。灵敏度优于RID，但仍低于紫外或荧光检测器。对挥发性流动相要求较高。
      • 配备紫外 (UV) / 二极管阵列 (DAD) / 荧光 (FLD) 检测器（需衍生化）： 单糖和寡糖本身在紫外区吸收弱或无吸收。常通过柱前或柱后衍生化赋予其强紫外吸收或荧光特性（如：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 (PMP) 衍生化）。大大提高灵敏度和选择性。
    • 离子色谱法 (IC)： 特别适用于糖醇和单糖、双糖的分离分析。使用阴离子交换色谱柱，在强碱性流动相条件下，糖分子被部分离解成阴离子。配备脉冲安培检测器 (PAD/HPAEC-PAD) 是目前最灵敏和选择性的糖检测方法之一，尤其适用于复杂基质（如食品、生物样品）中痕量糖的分析，通常无需衍生化。
    • 气相色谱法 (GC)： 适用于挥发性糖衍生物的分析。单糖和寡糖需经衍生化（如硅烷化、肟化硅烷化、乙酰化）以增加挥发性和热稳定性。配备火焰离子化检测器 (FID) 或质谱检测器 (GC-MS)。GC-MS 可提供强大的定性能力。对复杂的多糖分析受限。

  2. 光谱法 (Spectroscopy):

    • 近红外光谱法 (NIRS)： 基于分子中C-H、O-H、N-H等基团在近红外区的倍频与合频吸收。快速、无损、可在线检测。需建立稳健的校正模型（涉及大量标准样品和化学计量学方法），模型适用范围受样品类型、状态等影响。广泛应用于谷物、饲料等农产品的水分、蛋白质、脂肪、淀粉等成分的快速筛查。
    • 中红外光谱法 (MIR)/傅里叶变换红外光谱法 (FTIR)： 提供丰富的分子结构信息（指纹区）。结合衰减全反射 (ATR) 附件可方便地测定液体或固体样品。常用于定性分析和结构表征（如确定多糖中的糖苷键类型），定量分析需要建模。
    • 拉曼光谱法 (Raman)： 提供与红外光谱互补的分子振动信息。水干扰小，适合含水样品。在碳水化合物结构分析（如晶体结构、构象）方面有优势。定量应用也需建模。

  3. 酶法 (Enzymatic Methods)：

    • 利用高度特异性的酶催化反应，常用于测定特定种类的糖（如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉）。
    • 原理： 目标糖被特异性酶催化后，产生的产物（如NAD(P)H、过氧化氢）或消耗的辅酶（如ATP），可通过分光光度法或电化学法检测。
    • 优点： 特异性极高、灵敏度好（常用于微量分析）、干扰少、操作简单（有商品试剂盒）、适用于自动分析仪。
    • 缺点： 通常只能测单一组分或少数组分组合，测定不同糖需不同的酶试剂盒；成本相对较高；酶促反应受pH、温度、抑制剂影响。
    • 应用： 临床生化（血糖）、食品饮料分析（果汁、乳制品）、发酵过程监控等。

三、 特定类别检测：膳食纤维

膳食纤维的检测有其特殊性，主要包含两种主流方法：

  1. 酶-重量法 (Enzymatic-Gravimetric Methods)： 这是国内外标准（如AOAC、GB）广泛采用的方法。

    • 原理： 模拟人体胃肠道消化过程。样品经耐热α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶处理，去除可消化的淀粉和蛋白质。剩余的残渣主要是膳食纤维（包括不溶性膳食纤维IDF）。将残渣过滤、洗涤后烘干称重。
    • 可溶性膳食纤维 (SDF) 测定： 在酶解后将可溶性膳食纤维沉淀（常用乙醇沉淀），过滤、洗涤、烘干后称重，合并计算总膳食纤维 (TDF=IDF+SDF)。
    • 优点： 接近生理意义，可区分IDF和SDF。
    • 缺点： 耗时较长，对低含量样品误差较大。

  2. 酶-化学法 (Enzymatic-Chemical Methods)：

    • 在酶解去除可消化成分后，不采用重量法，而是将残留的膳食纤维（主要是非淀粉多糖）水解成单糖（如中性糖用硫酸水解，糖醛酸用特定方法水解），然后采用色谱法（如HPAEC-PAD、HPLC）或比色法（如间羟基联苯法测糖醛酸）定量测定各单糖组分，再换算回多糖含量。
    • 优点： 可提供膳食纤维的单糖组成信息。
    • 缺点： 步骤更繁琐，成本更高。

四、 新兴技术与挑战

  • 质谱联用技术： LC-MS/MS (特别是HILIC-MS/MS)、GC-MS/MS提供极高的灵敏度和特异性，适用于复杂基质中痕量糖的分析和结构确证。
  • 核磁共振波谱法 (NMR)： 主要用于碳水化合物的结构解析和构象研究，对复杂混合物定量分析较困难。
  • 生物传感器： 利用固定化酶、抗体或分子印迹聚合物结合电化学、光学换能器，发展快速、便携或在线检测装置，是一个活跃的研究领域。
  • 挑战： 碳水化合物种类繁多、结构复杂（异构体、同多糖/杂多糖、分支度）、极性大、缺乏强发色团、在复杂基质中共存干扰物的影响等，都给准确、快速、全面的分析带来挑战。分离技术、检测灵敏度和特异性仍需不断提高。

五、 方法选择与应用

选择何种检测方法取决于：

  1. 检测目标： 是总糖、还原糖、特定单糖/双糖、淀粉、膳食纤维还是多糖组分？
  2. 样品基质： 食品（液体、固体？成分复杂程度？）、生物体液、植物组织、环境样品等。
  3. 所需信息： 只需总量？需要区分不同糖种类？需要结构信息？
  4. 对准确度、精密度和灵敏度的要求。
  5. 分析通量和速度要求。
  6. 成本预算和实验室条件。

典型应用场景：

  • 食品营养标签： 总碳水化合物、总糖、膳食纤维含量测定（常用酶法、HPLC、酶重量法）。
  • 食品质量控制： 原料（如水果甜度/糖度）、加工过程监控（如淀粉水解程度）、产品特性（如乳制品中乳糖、果汁中糖谱）。
  • 生物医学研究： 血糖监测（酶电极法、HPLC）、尿液/血液中异常糖代谢标志物分析（LC-MS/MS）、糖蛋白分析。
  • 植物科学： 光合产物（蔗糖、淀粉）积累、种子品质分析（淀粉含量）、细胞壁多糖研究（NMR, FTIR）。
  • 发酵工业： 底物糖消耗、产物（如乙醇、有机酸）形成的监控（酶法、HPLC）。
  • 环境科学： 水体、土壤中有机质（含碳水化合物）的监测（TOC, 比色法）。

结论：

碳水化合物检测技术种类繁多，各具特色和适用范围。从经典的化学比色法到现代化的色谱、光谱、酶法和质谱联用技术，分析工作者可以根据具体的检测需求、样品特性和资源条件，选择最合适的方法或多种方法联用。随着技术的不断发展，尤其是高灵敏度、高特异性仪器分析技术和快速检测方法的进步，碳水化合物分析的精准度、效率和广度将持续提升，为相关领域的研究和应用提供更强大的技术支持。