肽核酸(PNA)合成

肽核酸(PNA)合成：原理、方法与挑战

肽核酸(PNA)作为一种独特的人工核酸类似物，因其卓越的核酸识别能力和稳定性，在分子生物学、诊断学和治疗学领域展现出巨大潜力。其合成的核心在于构建以中性肽链骨架（N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元）取代天然DNA/RNA中带负电的糖-磷酸骨架的结构，同时保留标准的碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶/尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶）。以下是PNA合成的关键技术要点：

一、 主流合成策略：固相合成

目前，PNA的合成主要依赖成熟的**固相多肽合成(SPPS)**技术，流程高度自动化且高效。

1. 固相载体选择：

   • 常用载体包括经处理的聚苯乙烯树脂（如王树脂）或聚乙二醇修饰的树脂（如Tentagel树脂），其表面连接有反应性官能团（羧基或氨基）。
   • 合成方向：通常采用**C端（羧基端）向N端（氨基端）**延伸的策略。第一个PNA单体（通常是C端单体）的C端通过稳定的酯键或酰胺键连接到固相载体上。

2. 单体保护基策略：

   • Nα-氨基保护：
     • Fmoc策略（9-芴基甲氧羰基）：最常用。Fmoc基团在温和的碱性条件下（通常用20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液）可高效脱除，对酸稳定。脱保护后暴露的α-氨基用于与下一个单体的羧基偶联。
     • Boc策略（叔丁氧羰基）：需用强酸（如三氟乙酸）脱除，对碱稳定。使用相对较少，但在合成特殊序列时仍有价值。
   • 碱基保护：
     • 胞嘧啶(C)：通常用苯甲酰基(Bz)或异丁酰基(Ibu)保护，防止副反应。
     • 腺嘌呤(A)：常用苯甲酰基(Bz)保护。
     • 鸟嘌呤(G)：常用异丁酰基(Ibu)或苯甲酰基(Bz)保护。鸟嘌呤的保护尤为重要，因其侧链易发生副反应且易形成聚集体。
     • 胸腺嘧啶(T)：通常无需特殊侧链保护。
   • 羧基活化： 脱除Nα-保护基后，下一个PNA单体需要被活化才能与生长链的游离氨基高效偶联。

3. 单体活化与偶联：

   • 单体羧基常用强效缩合剂活化，形成高反应活性的中间体（如活性酯、酰基脲、酰卤化物类似物等）。
   • 早期经典方法：Boc单体的氰基活化法。单体羧基预先转化为氰甲基酯，反应活性高，偶联效率好（尤其对困难序列），但氰基活化单体合成相对复杂。
   • 现代常用方法：采用高效缩合剂，如：
     • 碳二亚胺类化合物：如二异丙基碳二亚胺(DIC)或N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，常与活化添加剂联用以抑制消旋和副反应：
       • 1-羟基苯并三唑(HOBt)
       • 6-氯-1-羟基苯并三唑(HOAt)：效果通常优于HOBt。
       • 乙基氰基羟基亚氨基乙酸酯(Oxyma Pure)：副产物更少。
     • 鏻盐/脲鎓盐类缩合剂：如苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)等。它们通常反应更快、效率更高、消旋更少，是当前主流的活化方法。
   • 偶联反应在溶剂（如N,N-二甲基甲酰胺DMF、N-甲基吡咯烷酮NMP或二氯甲烷DCM）中进行。

4. 脱保护与洗涤：

   • 每次单体偶联完成后，需彻底洗涤树脂，移除过量的单体、缩合剂和副产物。
   • 脱帽（封闭未反应氨基）：在Fmoc策略中，如果偶联不完全，残留的游离氨基会影响后续合成纯度。通常使用乙酸酐/吡啶溶液或乙酰咪唑等乙酰化试剂封闭这些氨基。

5. 循环与链延伸：

   • 脱保护（Fmoc）：用哌啶/DMF溶液脱除刚连上的单体N端的Fmoc基团，暴露出游离氨基。
   • 洗涤：洗去脱保护试剂和副产物（二苯并富烯）。
   • 活化与偶联：将下一个被保护的PNA单体活化后加入，与游离氨基反应形成酰胺键。
   • 洗涤：洗去多余试剂。
   • 重复“脱保护->洗涤->偶联->洗涤”步骤，直至目标序列完全合成。

6. 切割与侧链全脱保护：

   • 合成完成后，需要将完整PNA链从固相载体上切割下来，并同时或分步移除所有碱基上的保护基团。
   • 切割/脱保护试剂： 常用强酸混合液处理树脂数小时。
     • 对于Fmoc策略（常用王树脂连接）：三氟乙酸(TFA)为主，通常加入强清除剂混合物（如TFA: 三异丙基硅烷: 水 = 95:2.5:2.5）以捕获脱保护产生的阳离子，防止其攻击PNA链或碱基。该混合液能高效切割PNA与树脂的酯键或酰胺键链接，并移除Bz、Ibu等碱基保护基。
     • 对于Boc策略（常用MBHA树脂连接）：常用无水氟化氢(HF)或三氟甲磺酸(TFMSA)。
   • 沉淀与洗涤： 将切割反应混合物加入冷的无水乙醚或甲基叔丁基醚中，PNA会沉淀析出。离心收集沉淀，并用冷乙醚多次洗涤以去除残留试剂和有机杂质。

7. 纯化：

   • 粗产物通常含有截短序列、缺失序列、脱保护不完全产物等杂质。
   • 高效液相色谱(HPLC)是标准纯化方法：
     • 反相HPLC(RP-HPLC)：最常用。利用PNA分子的疏水性差异进行分离。常用C18或C8色谱柱，以含三氟乙酸(TFA)的水溶液（缓冲液A）和乙腈/异丙醇（缓冲液B）作为流动相进行梯度洗脱。
     • 离子交换色谱(IEX)：有时用于纯化电荷差异较大的杂质或特定应用场景。
   • 收集目标峰馏分，冻干或真空浓缩得到纯化的PNA。

8. 分析与表征：

   • 质谱(MS)：确认分子量（ESI-MS或MALDI-TOF MS最常用）。
   • 高效液相色谱(HPLC)：评估纯度（通常要求>95%）。
   • 紫外光谱(UV)：确认碱基组成和浓度（利用碱基的特征吸收）。
   • 圆二色谱(CD)、核磁共振(NMR)：用于高级结构研究（非日常质控必需）。

二、 其他合成方法

1. 片段缩合法（液相合成）：
   • 先合成较短的PNA片段（如二聚体、三聚体、四聚体），然后在溶液中进行片段间的缩合反应。此法对长链合成效率较低，步骤冗长，纯化复杂，较少用于常规合成。
   • 可能用于合成特殊修饰或难以通过固相合成直接获得的长链PNA。

三、 PNA合成面临的挑战与优化策略

1. 精氨酸(Arg)单体： Arg侧链胍基碱性极强，在Fmoc脱保护（碱性条件）时易发生不可逆的副反应（如生成胍基衍生物）。解决方案包括：
   • 使用特殊保护基（如Pbf, Pmc, Mtr），其在TFA切割时同步脱除。
   • 优化脱保护条件（使用较低浓度的哌啶或加入HOAt）。
   • 将Arg置于序列C端（减少后续碱性处理次数）。
2. 鸟嘌呤(G)聚集： G碱基易通过π-π堆积形成稳定的聚集体（尤其是富含G的序列），导致合成效率低下、溶解性差和纯化困难。策略包括：
   • 使用强效活化试剂（HATU/HOAt）提高偶联效率。
   • 选用溶解性更好的树脂（如Tentagel）。
   • 合成中采用高温（如50-60°C）或强极性溶剂（如NMP）改善溶胀和传质。
   • 纯化时优化HPLC条件（如使用离子对试剂）。
3. 疏水性序列溶解性差： 全序列PNA或富含疏水碱基（如T）的PNA在合成后期或纯化过程中可能溶解性极差。解决方案：
   • 选择亲水性更强的树脂。
   • 在合成或切割混合物中加入强极性助溶剂（如六氟异丙醇HFIP）。
   • 优化切割/沉淀条件。
4. 困难序列的偶联： 空间位阻大或易形成二级结构的区域可能导致偶联效率低下。可尝试：
   • 更换更高效的活化体系（如HATU/DIPEA）。
   • 延长偶联时间或重复偶联步骤。
   • 提高偶联温度。
   • 使用假脯氨酸等特殊策略（在PNA中应用较少）。
5. 消旋： 合成过程中，α-碳可能发生轻微消旋（形成D-型异构体），尤其在活化或偶联步骤不当时。优化活化方法（如使用HOxPyU等低消旋缩合剂）和反应条件可减少消旋。

四、 应用与展望

高纯度、序列正确的PNA是其在诸多领域应用的基础：

• 分子杂交探针： 用于荧光原位杂交(FISH)、微阵列、实时PCR、SNP检测等。其高亲和力、强特异性及不被核酸酶降解的特性使其成为优异的诊断探针，能在复杂背景中检测特定核酸序列。
• 反义与抗原技术： 通过与mRNA或基因组DNA靶向结合，调控基因表达或抑制病原体。PNA的代谢稳定性是其优势，但细胞递送仍是主要挑战。
• 纳米技术与材料科学： 用于构建精密的核酸纳米结构(PNA-DNA hybrid structures)。
• 分子工具： 用于核酸纯化、PCR钳制(PCR clamping)、人工限制酶等。
• 治疗开发（潜力领域）： 针对遗传性疾病、感染性疾病和癌症的反义/抗原疗法研究持续进行。

结语

肽核酸的合成技术，特别是基于Fmoc策略的固相合成法，已发展得相当成熟和高效，成为获取各种PNA序列的标准途径。尽管在合成富含精氨酸、鸟嘌呤或高度疏水的序列时仍存在挑战，但通过优化单体保护策略、活化偶联体系、反应条件和纯化方法，这些难题正被逐步克服。随着合成技术的持续精进和递送策略的创新突破，PNA凭借其独特的优势，必将在基础研究、分子诊断和靶向治疗等领域发挥越来越关键的作用。