蛋白表达与纯化

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

蛋白表达与纯化技术指南

蛋白表达与纯化是分子生物学、生物化学和药物研发领域的核心实验技术，旨在获得大量高纯度、具有生物活性的目标蛋白质用于结构与功能研究、抗体生产、药物筛选等。以下是该技术的核心流程：

一、 基因克隆与载体构建

  1. 目标基因获取： 通过PCR、基因合成等方法获得编码目标蛋白的DNA序列。
  2. 表达载体选择：
    • 宿主类型：
      • 原核系统（常用大肠杆菌）： 操作简便、成本低、周期短、产量高。适用于不需复杂修饰的蛋白。缺点是易形成包涵体、缺乏真核修饰（如糖基化）。
      • 真核系统：
        • 酵母（如酿酒酵母、毕赤酵母）： 生长快、成本较低、可进行部分翻译后修饰、适合分泌表达可溶蛋白。
        • 昆虫细胞（杆状病毒表达系统）： 能进行复杂翻译后修饰（如糖基化、磷酸化），蛋白活性更接近天然状态。
        • 哺乳动物细胞： 能完成最接近天然的翻译后修饰，表达产物生物学活性高，但操作复杂、成本高、周期长、产量通常较低。
    • 载体元件： 强启动子（如T7, lac, TEF1）、多克隆位点、筛选标记（抗生素抗性基因）、融合标签（见下文纯化部分）、信号肽（用于分泌表达）等。
  3. 克隆： 将目标基因片段插入到选定的表达载体中，构建重组表达质粒。常用方法包括限制性酶切连接、Gibson组装、Gateway克隆等。
  4. 转化/转染： 将重组表达质粒导入宿主细胞。
    • 原核（大肠杆菌）：化学转化或电穿孔。
    • 真核：转染试剂（脂质体、磷酸钙等）、电穿孔或病毒感染（杆状病毒）。

二、 蛋白表达

  1. 小试表达优化：
    • 菌株/细胞系选择： 如针对毒性蛋白、二硫键形成、稀有密码子等选择特定菌株或细胞系。
    • 培养条件： 培养基种类、温度（常需低温诱导以增加可溶性）、起始密度（OD600）、诱导时机（对数生长期）。
    • 诱导剂浓度与时间： 如IPTG（原核）、甲醇（毕赤酵母）的浓度和作用时间直接影响表达水平和可溶性。需摸索最佳条件。
    • 目标： 最大化目标蛋白的可溶性表达量，最小化降解。
  2. 放大培养： 将优化后的条件放大到摇瓶或生物反应器中进行大量培养。
  3. 诱导表达： 加入诱导剂启动目标蛋白的转录和翻译。
  4. 收获： 培养结束后，通过离心收集细胞（细菌、酵母）或上清（分泌表达时）。

三、 细胞裂解与粗提物制备

  1. 细胞裂解：
    • 细菌/酵母：
      • 物理法： 超声破碎（最常用）、高压匀浆、冻融循环、玻璃珠研磨。
      • 化学/酶法： 溶菌酶处理（细菌）、渗透压休克、去垢剂（增溶膜蛋白或包涵体）。
    • 昆虫/哺乳动物细胞：
      • 去垢剂裂解： 温和但需考虑去垢剂对后续纯化的影响。
      • 冻融裂解： 反复冻融。
      • Dounce匀浆器： 机械破碎。
      • 低渗裂解： 适用于悬浮细胞。
  2. 离心/过滤： 裂解后离心或过滤去除细胞碎片和不溶物（包括可能形成的包涵体），得到含有可溶性目标蛋白的上清液（粗提物）。若目标是包涵体，则需洗涤沉淀。

四、 蛋白纯化

目标是分离目标蛋白，去除杂质（宿主蛋白、核酸、内毒素、脂质、色素等）。常采用多步层析组合。

  1. 亲和层析 (Affinity Chromatography)： 最常用、最有效的一步纯化方法。

    • 原理： 利用目标蛋白上特异性标签（Tag）与固定在填料上的配体（Ligand）之间的高亲和力、可逆结合。
    • 常用标签/配体系统：
      • 组氨酸标签 (His-Tag) + 金属螯合层析 (IMAC)： 最常见。His-Tag（通常是6xHis）与固定在填料上的二价金属离子（Ni²⁺, Co²⁺等）结合。优点：通用性强、条件温和（非变性）、成本较低。
      • 谷胱甘肽-S-转移酶标签 (GST-Tag) + 谷胱甘肽琼脂糖： GST与固定化谷胱甘肽(GSH)结合。优点：可增加融合蛋白可溶性，可利用GSH洗脱。
      • 麦芽糖结合蛋白标签 (MBP-Tag) + 交联淀粉 (Amylose Resin)： MBP与直链淀粉结合。优点：显著增加融合蛋白可溶性。
      • 抗体/抗原： 如Protein A/G用于抗体纯化。
      • 生物素/链霉亲和素： 亲和力极高。
    • 操作步骤：
      • 平衡：用结合缓冲液平衡亲和柱。
      • 上样：将粗提物上柱，目标蛋白结合。
      • 洗涤：用含低浓度竞争剂（如低浓度咪唑用于IMAC）或优化pH/盐浓度的缓冲液洗去非特异性结合的杂质。
      • 洗脱：用含高浓度竞争剂（如高浓度咪唑用于IMAC，高浓度GSH用于GST）、改变pH、加入变性剂（如盐酸胍用于包涵体洗脱）的缓冲液将目标蛋白特异性洗脱下来。
    • 去除标签： 许多标签（如His-Tag, GST-Tag）在后续研究中可能需要去除。在标签和目标蛋白之间设计特异性蛋白酶（如TEV蛋白酶、凝血酶、Factor Xa）的切割位点，纯化后酶切，再通过二次亲和层析（过原亲和柱）分离目标蛋白和标签/蛋白酶。

  2. 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography, IEX)： 基于蛋白质表面净电荷差异分离。

    • 类型：
      • 阴离子交换 (AEX)：填料带正电荷（如DEAE, Q），结合带负电荷蛋白；常用pH > pI。
      • 阳离子交换 (CEX)：填料带负电荷（如CM, SP），结合带正电荷蛋白；常用pH < pI。
    • 原理： 蛋白通过静电作用结合填料。改变洗脱缓冲液的离子强度（盐浓度梯度）或pH梯度，降低蛋白与填料的静电吸引力，使蛋白按结合力强弱依次洗脱。
    • 优点： 分辨率高、载量大、成本适中。
    • 应用： 常用作亲和层析后的精纯步骤，去除杂质、降解产物、核酸等。

  3. 疏水相互作用层析 (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)： 基于蛋白表面疏水性差异分离。

    • 原理： 在高盐浓度下暴露疏水区，结合到填料的疏水基团上。降低盐浓度削弱疏水作用进行洗脱（反向盐梯度）。
    • 应用： 特别适用于分离疏水性差异较大的蛋白（如去除聚集物）、或作为IEX的互补方法。常在亲和层析后，利用亲和洗脱液的盐浓度直接上样。

  4. 分子筛层析/凝胶过滤层析 (Size Exclusion Chromatography, SEC/Gel Filtration)： 基于蛋白质分子大小（流体动力学半径）差异分离。

    • 原理： 填料是多孔凝胶颗粒。分子量大的蛋白无法进入孔内，路径短，先流出色谱柱；分子量小的蛋白进入孔内，路径长，后流出色谱柱。
    • 特点： 等度洗脱（仅用一种缓冲液），无结合作用，条件温和，不改变样品组成。
    • 应用：
      • 精纯： 去除聚集体（大分子）和降解片段（小分子），提高均一性。
      • 脱盐/缓冲液置换： 快速去除小分子杂质（盐、咪唑、还原剂等），更换到所需缓冲液。
      • 分子量测定： 与已知分子量的标准品对比，估算样品分子量。
      • 分析复合物大小： 研究蛋白寡聚状态或复合物形成。

五、 纯化后处理与分析

  1. 浓缩： 采用超滤离心管（切向流过滤）、冷冻干燥、沉淀（丙酮、硫酸铵）等方法将洗脱的稀释蛋白溶液浓缩。
  2. 缓冲液置换/脱盐： 使用脱盐柱（分子筛层析的一种应用）或透析袋，将蛋白置换到储存或后续实验所需的缓冲液中（如PBS、Tris-HCl等），去除残留的盐、咪唑、还原剂等。
  3. 除菌过滤： 使用0.22 μm孔径的滤膜进行过滤除菌，便于长期储存。
  4. 质量控制与分析：
    • SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)： 最基本、最常用的纯度分析方法。通过考马斯亮蓝染色或银染观察主带大小和纯度，估算分子量。
    • 紫外可见分光光度法： 测定蛋白浓度（280 nm吸光度，利用蛋白中芳香族氨基酸的吸收特性，需注意核酸干扰）。
    • 蛋白质印迹 (Western Blotting)： 利用特异性抗体检测目标蛋白的存在及纯度（需考虑降解片段）。
    • 质谱分析 (Mass Spectrometry, MS)： 精确测定分子量、确认序列、鉴定翻译后修饰。
    • 活性分析 (Activity Assay)： 测定纯化蛋白是否具有预期的生物学活性（如酶活、结合活性、细胞活性等），这是纯化成功最重要的指标之一。
    • 内毒素检测： 特别是用于细胞实验或体内应用的蛋白，需检测内毒素水平（常用鲎试剂法）。

六、 常见问题与对策

  • 低表达量： 优化表达条件（温度、诱导剂浓度/时长、培养基）、更换宿主菌/载体、检查基因序列（密码子偏好性、mRNA稳定性）。
  • 不可溶（包涵体）： 降低诱导温度（如25-30°C）、缩短诱导时间、降低诱导剂浓度、更换表达菌株（如BL21(DE3)pLysS）、添加伴侣蛋白或融合可溶性标签（如MBP, GST）、尝试不同培养基或添加物（山梨醇、蔗糖、甘氨酸甜菜碱）、尝试分泌表达（如有信号肽）。如仍不可溶，需在变性条件下（尿素或盐酸胍）纯化包涵体，再复性。
  • 蛋白降解： 低温操作、加入蛋白酶抑制剂混合物（抑制丝氨酸、半胱氨酸、金属蛋白酶等）、缩短纯化时间、使用蛋白酶缺陷型宿主菌株（如大肠杆菌BL21(DE3)及其衍生株）、纯化时加入蛋白酶抑制剂。
  • 非特异性结合： 优化洗涤缓冲液条件（增加盐浓度、改变pH、加入低浓度咪唑、添加非离子去垢剂如Triton X-100或Tween-20），增加洗涤体积或次数。
  • 纯化后聚集： 避免过度浓缩、优化储存缓冲液（添加稳定剂如甘油、糖类、低浓度去垢剂、还原剂）、分装储存于-80°C、避免反复冻融。
  • 内毒素污染: 选择不含内毒素的成分（缓冲液、水）、使用低内毒素级别的层析填料、在纯化后期（如IEX或SEC）去除内毒素、使用特定吸附剂（如多粘菌素B琼脂糖）处理。

七、 应用

纯化的蛋白质广泛应用于：

  • 生物化学研究： 酶动力学、蛋白-蛋白/蛋白-核酸相互作用、结构解析（X射线晶体学、核磁共振、冷冻电镜）。
  • 药物研发： 靶点蛋白筛选、抗体药物生产、疫苗开发。
  • 诊断试剂： 抗原、抗体、酶标记物。
  • 生物技术： 工业酶（洗涤剂、食品加工）、生物传感器、生物材料。

总结：

蛋白表达与纯化是一项系统性的技术，涉及分子克隆、细胞培养、生物化学和层析技术等多学科知识。成功的关键在于根据目标蛋白的特性（大小、电荷、疏水性、溶解度、修饰需求等）和最终应用目的，精心设计和优化每一步骤，包括选择合适的表达系统、载体标签、裂解方法以及层析纯化策略的组合。严谨的操作、详细的记录以及对纯化蛋白质量的全面分析（纯度、浓度、完整性、活性、内毒素等）至关重要。随着技术的发展，自动化高通量表达纯化平台也在不断进步，为大规模蛋白生产提供了有力支持。