sgRNA/pegRNA设计及合成

sgRNA/pegRNA设计及合成技术指南

引言 sgRNA（单导向RNA）和pegRNA（引物编辑向导RNA）是CRISPR基因编辑系统的核心组件。sgRNA引导Cas9蛋白靶向特定基因组位点进行切割，实现基因敲除或基于同源定向修复（HDR）的编辑。pegRNA则用于更精确、更灵活的“先导编辑”技术，能在不依赖DNA双链断裂和供体模板的情况下实现多种类型的碱基替换、小片段插入或删除（indels）。掌握其设计与合成方法是基因编辑实验成功的关键。

一、 sgRNA设计原则

sgRNA的长度通常为20个核苷酸，位于其3'端的NGG序列（称为PAM，原型间隔相邻基序）是SpCas9识别的标志（其他Cas变体识别不同PAM）。目标编辑位点必须紧邻PAM序列（5'-N20-NGG-3'）。

1. 靶点选择：

   • 特异性： 使用权威基因组数据库比对，确保设计的sgRNA序列在全基因组范围内具有唯一性（推荐≥3个碱基错配）。避免富含重复序列区域。
   • 位置： 根据编辑目的选择靶点位置。敲除需靠近编码区起始位置；HDR需靠近预编辑位点（理想距离<10-50 bp）。
   • GC含量： 推荐40%-60%。GC过低稳定性差，GC过高可能增加脱靶风险。
   • 避免多聚碱基： 避免连续4个及以上相同碱基（如TTTT, GGGG）。

2. 序列设计流程：

   • 确定目标编辑区域及其上下游序列。
   • 搜索符合“N20-NGG”格式的所有潜在靶点序列。
   • 使用在线设计工具（如CRISPRscan, CHOPCHOP, Benchling）进行特异性打分、潜在脱靶位点预测、GC含量分析。
   • 对得分较高的候选sgRNA进行脱靶效应评估（尤其关注预测的高分脱靶位点是否位于功能基因区）。
   • 选择2-3个最优候选进行实验验证。

二、 pegRNA设计原则

pegRNA在sgRNA基础上增加了两个关键功能域（位于3'端）：

• 引物结合位点（PBS）： 13-17 nt，与靶DNA切断后产生的非模板链（RTT结合前）互补结合，作为逆转录引物。
• 逆转录模板（RTT）： 10-25 nt（含编辑序列），包含期望的编辑序列及其3'端侧翼同源序列。模板序列需与靶位点模板链互补。

pegRNA整体结构：5' - [20 nt spacer/gRNA序列] - [gRNA scaffold] - [PBS] - [RTT] - 3'

1. 编辑序列设计：

   • 明确目标编辑类型（点突变、插入、缺失）。
   • 在RTT中设计包含所需编辑的序列。所需编辑应位于RTT的5'端部分（靠近PBS端）。

2. PBS设计：

   • 长度： 13-17 nt（常用13-15 nt）。
   • Tm值： 推荐30°C-60°C（常用工具计算）。Tm过低结合弱，过高可能阻碍编辑复合物解离或增加错误结合风险。
   • 位置： PBS必须与Cas9切割位点3'端下游的非模板链序列（切割后暴露的单链区）精确互补。切割位点位于PAM上游第3个碱基处（N20-NGG^|N，切割点在^处）。
   • 避免二级结构： 尽量减少PBS自身或与邻近序列形成稳定的二级结构。

3. RTT设计：

   • 长度： 包含编辑序列及其3'端足够的同源臂（通常总长10-25 nt）。同源臂长度需保证编辑效率（通常≥10 nt）。
   • 编辑位置： 期望的编辑点应位于RTT的5'端（紧接PBS之后）。
   • 避免互补性： RTT序列不应与PBS或spacer序列存在显著互补性，防止形成阻碍逆转录的二级结构。
   • 同源性： RTT的3'端（同源臂）必须与靶位点Cas9切割位点3'端下游的模板链序列精确互补。切割位点下游的同源臂长度影响效率和保真度。

4. 整体优化：

   • spacer部分： 遵循sgRNA设计原则（特异性、GC含量等）。
   • GC含量： 整个pegRNA（尤其PBS+RTT）GC含量建议40%-60%。
   • 结构预测： 使用RNA折叠软件预测pegRNA的二级结构，避免PBS或RTT关键区域被包裹。
   • 工具辅助： 使用专门的pegRNA设计工具（如pegFinder, PE-Designer）可自动化上述流程并提供打分。

三、 sgRNA/pegRNA的合成

sgRNA/pegRNA主要通过两种方法制备：化学合成和体外转录（IVT）。

1. 化学合成：

   • 原理： 基于固相亚磷酰胺三酯法，在自动化合成仪上由3'端向5'端逐步添加核苷酸。
   • 优点：
     • 精准性： 可合成任意序列，包括大量修饰碱基（如硫代磷酸、2'-O-甲基、锁核酸）。
     • 高纯度： 经HPLC纯化可获得极高纯度的终产物（>95%）。
     • 长度优势： 尤其适合合成较长的pegRNA（可达200 nt）。
   • 缺点：
     • 成本： 长度越长，成本越高昂。
     • 规模限制： 大规模合成成本效益低。
   • 关键步骤：
     • 序列输入与修饰： 提供精确序列，指定修饰位点（如5'端磷酸化利于连接）。
     • 合成： 在合成仪上进行循环偶联、加帽、氧化等反应。
     • 脱保护与切割： 从固相载体上切下RNA并去除保护基团。
     • 纯化： 采用HPLC或PAGE进行精细纯化，去除缺失序列、截短体杂质。
     • 质控： 质谱测定分子量，分析色谱图评估纯度。

2. 体外转录（IVT）：

   • 原理： 利用噬菌体RNA聚合酶（如T7, SP6, T3）在体外以DNA模板指导合成RNA。
   • 优点：
     • 成本效益： 特别适合大规模制备（微克至毫克级）。
     • 操作简便： 流程相对标准化。
   • 缺点：
     • 序列限制： 需要5'端特定的启动子序列（如T7启动子要求5'-GGG或GA开头）。
     • 均一性： 产物可能包含异质3'端（非模板加尾）。
     • 修饰困难： 引入特殊化学修饰不如化学合成方便。
     • 长度限制： 超长转录本（>150 nt）效率可能降低。
   • 关键步骤：
     • 模板制备：
       • 引物法： 设计包含启动子序列（如T7启动子：5'-TAATACGACTCACTATAG-3'）的正向引物和反向引物，通过PCR扩增获得线性双链DNA模板。
       • 质粒法： 将目标序列克隆到含相应启动子的质粒中，酶切线性化质粒。
     • 体外转录反应： 在含NTPs、Mg²⁺、缓冲液、RNA酶抑制剂和RNA聚合酶的体系中孵育模板DNA。
     • DNA模板去除： 加入DNase I消化模板DNA。
     • 纯化： 常用沉淀法（乙醇/异丙醇沉淀）或柱纯化法（硅胶膜或离心柱）去除蛋白质、盐离子、未掺入的NTPs和短片段RNA。高要求时可用PAGE纯化。
     • 质控： 琼脂糖凝胶电泳检测大小和纯度，Nanodrop分光光度计定量。

3. 合成策略选择：

   • sgRNA: 化学合成（常用，尤其带修饰）和IVT均可。
   • pegRNA: 强烈推荐化学合成。因其结构复杂、较长、常需修饰以提高稳定性，化学合成在精准性、纯度和定制灵活性上更具优势。

四、 应用与重要性

• sgRNA: CRISPR-Cas9基因敲除（Knockout）、CRISPRi/a（干扰/激活）、基于HDR的精准基因敲入（Knock-in）或点突变修复。
• pegRNA: 先导编辑（Prime Editing）。优势：
  • 编辑类型广： 所有12种碱基转换、小片段插入/缺失。
  • 无需DSB： 显著降低indels等副产物和染色体畸变风险。
  • 无需供体DNA： 简化实验设计，提高效率（尤其难转染细胞）。
  • 灵活性高： 编辑位置选择自由度更大（理论上靶点只需靠近PAM）。
  • 保真度高： 编辑副产物相对较少。

五、 质量控制与储存

• 纯度： HPLC峰图单峰，PAGE胶图主带清晰无杂带。
• 完整性： 质谱确认分子量准确，凝胶电泳确认条带大小正确。
• 浓度： 分光光度法精确定量（OD260，考虑消光系数）。
• 功能性验证： 在细胞模型或体外切割实验中验证活性（最重要）。
• 储存： 溶解于无RNase水或缓冲液（如10 mM Tris-HCl, pH 7.5），分装后-80°C长期保存。避免反复冻融。

结论

sgRNA和pegRNA的设计与合成是CRISPR技术成功应用的基石。精确遵循sgRNA的设计规则（特异性、GC含量、位置）是基础。pegRNA的设计更为复杂，需精心构建PBS和RTT，并利用专业工具进行优化。在合成路线上，化学合成凭借其精准性和灵活性，尤其适用于结构复杂且常需修饰的pegRNA制备；而IVT则是大规模制备sgRNA的经济之选。严格的质量控制和功能验证是确保编辑效率和安全性的最终保障。随着基因编辑技术的飞速发展，sgRNA/pegRNA的设计合成策略将持续优化，为基础科研和未来基因治疗提供更强大的工具。