磷酸果糖激酶检测

检测项目名称： 磷酸果糖激酶活性测定

检测方法： 常用方法为分光光度法 (速率法)

原理： 基于磷酸果糖激酶 (PFK) 催化的特异性反应： 果糖-6-磷酸 (F6P) + ATP → 果糖-1,6-二磷酸 (F1,6-BP) + ADP 通过偶联多个辅助酶反应（通常涉及磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶），将反应产生的 ADP 转化为 ATP，同时消耗 NADH。通过监测特定波长（通常是 340 nm）下 NADH 吸光度的下降速率（ΔA/min），该速率与样品中 PFK 的活性成正比。
主要步骤：
1. 制备含有适当缓冲液、底物（F6P、ATP）、辅助酶、辅因子（NADH、Mg²⁺）等的反应混合液。
2. 加入预处理的样品（如溶血液或组织匀浆上清液）。
3. 在恒温（通常为 37°C）条件下，立即于分光光度计中监测 340 nm 波长处吸光度随时间的变化。
4. 计算单位时间内吸光度的变化值（ΔA/min）。
5. 根据公式计算 PFK 活性： PFK 活性 (U/L) = (ΔA/min × 反应总体积 × 1000) / (消光系数 × 光径 × 样品体积)
  - 其中，NADH 在 340 nm 的毫摩尔消光系数通常为 6.22 L·mmol⁻¹·cm⁻¹。
  - U/L 定义：在特定反应条件下，每分钟催化转化 1 微摩尔底物所需的酶量。

样本要求：

样本类型：
- 红细胞溶血液： 诊断 PFK 缺乏相关溶血性贫血的首选样本。采集抗凝全血（肝素或 EDTA 抗凝），尽快分离红细胞，用生理盐水洗涤数次去除血浆和白细胞，最后用蒸馏水或低渗缓冲液裂解红细胞制备溶血液。
- 肌肉组织匀浆： 用于诊断 PFK 缺乏相关肌病（糖原累积病 VII 型）。通常在肌肉活检时获取新鲜肌肉组织，快速冷冻（液氮）保存或立即处理。检测前需在低温下匀浆、离心取上清液。
- 白细胞： 可作为替代样本，但活性低于红细胞，且制备相对复杂。
样本采集与处理：
- 关键： PFK 对温度和 pH 敏感。采集后样本应尽快处理并置于冰上。制备好的溶血液或组织匀浆上清液应尽快检测，如需保存，应分装后置于 -70°C 或更低温度冻存，避免反复冻融。
- 避免溶血： 对于非红细胞样本（如血浆、血清）的采集，应严格避免溶血，以免红细胞 PFK 污染干扰结果。
样本运输： 全血或组织样本需在冰上（4°C）条件下尽快运送至实验室。冻存的溶血液或组织匀浆上清液应在干冰条件下运输。

参考区间：

参考区间因检测方法、实验室条件、样本类型（红细胞、肌肉）以及个体年龄（儿童、成人）的不同而有差异。
红细胞 PFK 活性： 通常高于白细胞或肌肉。健康成人红细胞 PFK 活性范围大致在 10 - 20 U/g Hb 或 X - Y IU/g Hb (具体数值需参考检测实验室提供的基于本地人群建立的参考范围)。
肌肉 PFK 活性： 显著高于红细胞。健康成人肌肉 PFK 活性范围较大，通常大于 50 U/g 蛋白 或 XX - YY IU/g 蛋白。
重要提示： 每个实验室必须建立和使用自己的参考区间。结果解读应严格依据检测报告单上提供的实验室特定参考范围。

临床意义： 磷酸果糖激酶 (PFK) 是糖酵解途径中关键的限速酶之一，催化果糖-6-磷酸 (F6P) 磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸 (F1,6-BP)。PFK 活性检测主要用于诊断遗传性磷酸果糖激酶缺乏症及其相关疾病。

Tarui 病 (糖原累积病 VII 型)：
- 肌肉型： 由 PFKM 基因突变导致骨骼肌 PFK 活性显著降低或缺失。临床表现为运动不耐受、运动后肌肉疼痛痉挛、肌球蛋白尿（可导致急性肾损伤）、部分患者有轻度溶血性贫血。红细胞 PFK 活性通常为正常值的 50% 左右（因为红细胞表达 PFKL 和 PFKP 同工酶）。
- 复合型/全身型： 罕见，涉及多个同工酶缺陷，临床表现更严重，可累及神经系统。
PFK 缺乏相关溶血性贫血：
- 由 PFKL 或 PFKP 基因突变导致红细胞内 PFK 活性显著降低或缺失（通常低于正常值的 10-25%）。表现为慢性溶血性贫血（代偿性或轻度），网织红细胞增多，脾肿大常见。关键生化特征： 红细胞内 F6P 堆积，葡萄糖-6-磷酸 (G6P) 消耗减少，导致 G6P/F6P 比值显著降低（常作为诊断线索）。患者通常没有明显的肌病症状。
辅助诊断与鉴别诊断：
- 用于鉴别慢性非球形红细胞溶血性贫血 (CNSHA) 的病因（如与其他酶缺乏如丙酮酸激酶缺乏鉴别）。
- 评估不明原因的肌病（尤其运动诱发症状伴肌球蛋白尿者）是否与糖代谢异常有关。
- 结合临床表现和基因检测确诊相关遗传性疾病。
结果解读：
- 显著降低（低于正常值的 50%，尤其是低于 10-25%）： 强烈提示 PFK 缺乏症。需结合样本类型（红细胞活性低指向溶血型；肌肉活性低指向肌病型）和临床表现。
- 轻度降低或临界值： 需谨慎解读，可能与杂合子状态、样本处理不当、实验干扰或部分缺陷型有关。需结合其他生化指标（如 G6P/F6P 比值）和基因分析。
- 正常： 通常可排除显著的 PFK 缺乏症。
- 升高： 临床意义不大，罕见报道，可见于某些恶性肿瘤细胞或增殖旺盛的组织。

结果解释注意事项：

样本质量至关重要： 溶血、延迟处理、保存不当导致的酶失活会造成假性降低。检测报告中应注明样本状态。
同工酶复杂性： PFK 有多个同工酶（PFKM - 肌肉/红细胞， PFKL - 肝脏/红细胞， PFKP - 血小板/其他组织）。不同组织表达不同组合。检测结果反映的是所测样本中该组织主要同工酶的活性。例如：
- 红细胞表达 PFKM 和 PFKL。
- 肌肉主要表达 PFKM。
- 检测红细胞 PFK 活性只能反映红细胞内酶活性，不能代表肌肉或其他组织。
杂合子与残余活性： 杂合子携带者通常无症状，其酶活性可能在正常低限或轻度降低（常为正常值的 40-60%）。部分 PFK 突变类型可能导致残余活性，临床表现轻重不一。
继发性改变： 某些获得性疾病（如严重肝病）理论上可能影响酶活性，但 PFK 检测主要用于遗传性疾病的诊断，继发性改变较少成为临床关注点。
临床结合： PFK 缺乏症的诊断不能仅依赖酶活性检测。需紧密结合患者的临床表现、家族史、血液学检查（溶血证据）、生化特征（如 G6P/F6P 比值），并最终通过 基因检测 确认致病突变。
局限性：
- 对于肌肉型 PFK 缺乏（Tarui 病），肌肉活检是金标准样本，红细胞检测可能正常或仅轻度降低。
- 某些罕见的突变类型可能影响酶活性检测的准确性。
- 对于运动诱发症状的患者，静息状态下的酶活性可能正常，有时需要结合运动试验或肌肉病理检查。

总结： 磷酸果糖激酶 (PFK) 活性检测是诊断遗传性磷酸果糖激酶缺乏症（包括 Tarui 病和相关溶血性贫血）的关键实验室依据。精确的检测依赖于严格的样本采集、处理和标准化的分光光度法。结果的解读必须考虑样本类型、实验室特定的参考区间、同工酶的复杂性、以及最重要的临床背景信息（症状、体征、其他实验室结果）。该检测为临床医生提供了重要的生化证据，最终确诊通常需要基因检测的支持。