己糖激酶检测

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

己糖激酶检测：原理、应用与操作要点

一、检测原理

己糖激酶（HK）检测基于其核心生物催化功能：在ATP存在下催化葡萄糖等己糖磷酸化，生成6-磷酸葡萄糖（G-6-P）。检测体系通过偶联其他酶促反应将这一过程转化为可测量的信号：

  1. 核心反应：
    • 葡萄糖 + ATP → G-6-P + ADP (由己糖激酶催化)
  2. 信号偶联反应 (常用)：
    • G-6-P + NADP⁺ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H⁺ (由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化)

反应产生的 NADPH 在 340 nm 波长处具有特异性吸收峰。通过监测反应体系中 340 nm 吸光度 (A340) 随时间的变化速率，即可计算出NADPH的生成速率，该速率直接反映己糖激酶的活性。

二、主要应用场景

  1. 血清/血浆HK活性测定：
    • 肝脏疾病诊断与监测： 血清HK活性显著升高是肝细胞损伤（如病毒性肝炎、药物性肝损伤、肝硬化活动期）的敏感指标，尤其在急性肝损伤时升高早于ALT/AST。肝癌患者血清HK也常升高，特别是其同工酶HK-II。
    • 肌肉疾病辅助诊断： 某些肌病（如肌营养不良）可能导致血清HK活性轻微升高。
    • 溶血性疾病评估： 红细胞富含HK，严重溶血时血清HK活性可因红细胞破坏而升高（需注意区分溶血干扰与病理升高）。
  2. 组织/细胞裂解液中HK活性测定：
    • 代谢研究： 评估组织（如肝脏、肌肉、脑、肿瘤组织）或细胞（如培养细胞）的糖酵解通路关键酶活性，研究能量代谢状态、药物作用机制、基因功能等。
    • 肿瘤研究： 研究肿瘤细胞（尤其是HK-II同工酶）在Warburg效应（有氧糖酵解）中的作用，探索肿瘤代谢重编程机制及潜在治疗靶点。
  3. 红细胞HK缺乏症诊断： 检测红细胞内HK活性是诊断遗传性非球形红细胞溶血性贫血的重要依据。
  4. 酶学性质研究： 分析酶动力学参数（如Km, Vmax）、最适pH、温度、抑制剂/激活剂效应等。

三、操作流程概要 (以分光光度法为例)

  • 样本准备：
    • 血清/血浆： 新鲜采集，避免溶血。及时分离，4℃短期保存或-20℃/-80℃长期冻存。避免反复冻融。
    • 组织/细胞： 新鲜取材，迅速匀浆或裂解于预冷的缓冲液中（常含蛋白酶抑制剂）。离心取上清液作为酶源。测定蛋白浓度以标准化结果。
    • 红细胞： 洗涤去除血浆和白细胞，制备溶血液。
  • 试剂配制： 根据选定方法配制包含以下成分的反应缓冲液：
    • Tris-HCl或HEPES缓冲液 (维持最适pH，约7.5-8.0)
    • 氯化镁 (MgCl₂, HK和G6PD的辅助因子)
    • ATP (底物)
    • NADP⁺ (辅因子)
    • 葡萄糖 (底物)
    • 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PD, 偶联酶)
    • 可添加KCN或EDTA抑制样本中可能存在的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶干扰
  • 反应体系建立：
    1. 将预温至检测温度（常为25°C、30°C或37°C）的缓冲液/试剂混合液加入比色杯。
    2. 加入适量样本（血清、组织上清液或溶血液）。
    3. 混匀，孵育片刻使温度平衡。
    4. 加入启动试剂（通常是葡萄糖或ATP，具体取决于方案设计），迅速混匀。
  • 信号监测：
    • 立即将比色杯放入预热的分光光度计中。
    • 在340 nm波长下，连续监测吸光度(A340)变化至少3-5分钟（或按方案要求）。
    • 记录吸光度随时间变化的线性区间。
  • 结果计算：
    • 计算线性区间内A340的变化速率 (ΔA/min)。
    • 根据朗伯-比尔定律和反应原理计算酶活性：
      • 活性单位 (U/L) = (ΔA/min) * (反应总体积 / 样本体积) * (1000 / 消光系数)
      • NADPH在340 nm的摩尔消光系数通常取 6.22 L mmol⁻¹ cm⁻¹。
    • 组织/细胞样本： 结果需用测定的总蛋白浓度进行标准化，表示为 U/mg protein。
    • 红细胞样本： 结果常以每克血红蛋白(Hb)的酶活性单位表示 (U/g Hb)。

四、关键注意事项与质量控制

  1. 样本处理：
    • 避免溶血： 红细胞富含HK，血清/血浆溶血会显著干扰结果。
    • 及时处理与保存： HK在室温下可能失活。血清/血浆应尽快分离并低温保存。组织/细胞样本应快速处理并冻存。
    • 蛋白浓度测定： 组织/细胞裂解液必须准确测定总蛋白浓度用于结果标准化。
  2. 试剂与反应条件：
    • 试剂稳定性： NADP⁺、ATP等试剂对光、热敏感，应新鲜配制或妥善保存。G6PD活性需保证。
    • 最适条件： 严格遵循方案要求的pH、温度、底物浓度（需远高于Km值，通常5-10倍以上）。
    • 线性范围： 确保吸光度变化速率在线性区间内（ΔA/min通常建议在0.02-0.2之间），必要时稀释样本。
    • 空白对照： 设置试剂空白（不加样本）和/或样本空白（不加启动底物如葡萄糖）以扣除背景干扰。
  3. 仪器校准： 确保分光光度计波长准确、光程正确、温控精确。定期校准。
  4. 干扰因素：
    • 溶血： 如前所述，是血清检测的主要干扰。
    • 胆红素/脂血： 严重黄疸或脂血样本可能在340nm有吸收干扰，需设置合适的空白或采用双波长法。
    • 内源性G6PD缺乏： 样本（尤其是红细胞）若缺乏G6PD，会限制偶联反应，导致假性低值。加入过量G6PD可解决。
    • 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (6PGD)： 某些样本含此酶，会消耗NADPH产生干扰。通常加入KCN或EDTA抑制其活性。
  5. 标准品/质控品： 使用经过认证的酶活性标准品或已知活性的质控血清进行校准和日常质控，监控方法的精密度和准确度。
  6. 同工酶识别： 临床关注HK-II（肿瘤相关）。可通过电泳、层析、特异性抑制剂或抗体方法区分同工酶。

五、方法学评价

  • 优点：
    • 特异性高： 基于酶的特异性催化反应及NADPH的特异性吸收。
    • 灵敏度高： 可检测低水平的酶活性。
    • 精密度好： 操作规范条件下，批内和批间变异系数较小。
    • 操作相对简便： 自动化分析仪易于实现标准化操作。
  • 局限性：
    • 样本要求高： 对溶血、保存条件敏感。
    • 干扰因素存在： 需注意并排除胆红素、脂血、内源性酶缺乏等干扰。
    • 仪器依赖： 需要紫外/可见分光光度计或生化分析仪。
    • 同工酶区分需额外方法： 标准活性检测不能直接区分同工酶。

六、总结

己糖激酶检测是基于其催化葡萄糖磷酸化并与G6PD偶联生成NADPH的分光光度法。该方法是评估肝脏损伤、研究细胞（尤其是肿瘤细胞）糖代谢状态、诊断红细胞酶缺乏症等不可或缺的工具。严谨的样本处理、规范的实验操作、严格的质量控制以及对干扰因素的充分认识，是获得准确可靠结果的关键。理解检测原理有助于正确解读结果，为临床诊疗和基础研究提供重要的生物化学信息。