柠檬酸合酶检测

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：1 作者：生物检测中心
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柠檬酸合酶活性检测方法

一、 检测原理

柠檬酸合酶（Citrate Synthase, CS， EC 2.3.3.1）是三羧酸循环（TCA循环）中的第一个关键限速酶，催化草酰乙酸（Oxaloacetate）与乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）缩合生成柠檬酸（Citrate）和游离的辅酶A（CoA-SH）。该酶活性常作为线粒体含量、完整性和细胞有氧代谢能力的标志物。

本检测方法基于以下酶促反应及后续衍生反应：

  1. CS 催化反应：
草酰乙酸 + 乙酰辅酶A → 柠檬酸 + 辅酶A (CoA-SH)
  1. 衍生显色反应（Ellman’s 反应）： 生成的游离辅酶A（CoA-SH）含有游离巯基（-SH），可与5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)， DTNB）发生反应。DTNB被还原后生成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB⁻），该产物在412 nm波长处具有强吸收峰。
CoA-SH + DTNB → CoA-S-S-TNB + TNB⁻ (黄色)在适当条件下，反应体系中生成的TNB⁻的量与CS催化生成的CoA-SH量成正比，进而与CS的酶活性成正比。因此，通过监测412 nm波长处吸光度（A412）随时间的变化速率，即可计算出CS的酶活性。

二、 主要试剂与材料

  • 缓冲液：
    • 反应缓冲液（常用）： 100 mM Tris-HCl 缓冲液（含 0.1% Triton X-100），pH 8.0 - 8.2（25°C）。Triton X-100有助于细胞或线粒体膜通透性。
    • 提取缓冲液（用于组织/细胞样本）： 一般包含蔗糖（~250 mM）、HEPES 或 Tris（~20 mM, pH 7.4）、EDTA（~1 mM）、蛋白酶抑制剂等，维持渗透压和保护酶活性。
  • 底物：
    • 草酰乙酸溶液（OAA）： 现配或用前解冻新鲜配制。浓度通常在0.2 - 0.5 mM（终浓度）。
    • 乙酰辅酶A溶液（Acetyl-CoA）： 冻干粉溶解于水中，现配或用前解冻新鲜配制。浓度通常在0.1 - 0.3 mM（终浓度）。
  • 显色剂：
    • DTNB溶液： 溶解于反应缓冲液中，终浓度通常为0.1 - 0.3 mM。
  • 终止剂（可选）： 某些方法在特定时间点加入强酸（如三氯乙酸或高氯酸）终止反应。
  • 标准品（可选）： 还原型谷胱甘肽（GSH）溶液，用于制作标准曲线（验证吸光度与巯基浓度的线性关系）。
  • 其他： 去离子水。

三、 主要仪器设备

  • 紫外-可见分光光度计（配备恒温比色皿架）
  • 恒温水浴锅或恒温循环器
  • 微量移液器（覆盖所需体积范围）及配套吸头
  • 石英或玻璃比色皿（光程通常为1 cm）
  • 离心机（用于样本前处理）
  • 匀浆器或超声破碎仪（用于组织/细胞样本）
  • 计时器
  • 冰浴装置
  • pH计

四、 样本制备

  1. 组织样本：
    • 新鲜组织在冰冷的提取缓冲液中剪碎。
    • 冰浴条件下，使用合适的匀浆器将其匀浆（注意控制温度和时间，避免过热失活）。
    • 将匀浆液在4°C，10000 - 15000 g下离心10 - 20分钟。
    • 小心吸取上清液（即含有柠檬酸合酶的粗提液），置于冰上待测。蛋白浓度需测定（如BCA法）。
  2. 培养细胞样本：
    • 收集细胞，冰冷的PBS洗涤。
    • 加入适量冰冷提取缓冲液重悬细胞。
    • 冰浴条件下进行超声破碎（短时、多次、间隔冰浴冷却）或反复冻融裂解。
    • 离心（同上）去除细胞碎片，取上清液置于冰上待测。测定蛋白浓度。
  3. 线粒体样本：
    • 按标准方法分离纯化线粒体。
    • 将线粒体沉淀用少量提取缓冲液（或含适量Triton X-100的反应缓冲液）重悬、裂解（如冻融或温和超声）。
    • 离心去除不溶物，取上清液置于冰上待测。测定蛋白浓度。
  • 注意： 所有操作尽可能在0-4°C冰浴中进行，以保护酶活性。样本应在短时间内测定，或分装后于-80°C冻存（避免反复冻融）。

五、 检测步骤（动力学法 - 普遍推荐）

  1. 预热： 开启分光光度计，设定波长至412 nm。预热比色皿架至所需反应温度（通常为25°C或30°C，需明确注明）。
  2. 配制工作液（临用前配制）：
    • 在反应缓冲液中加入所需量的DTNB溶液，混匀（DTNB工作液）。
    • 草酰乙酸溶液置于冰上。
    • 乙酰辅酶A溶液置于冰上。
  3. 设置反应体系（示例体积，可根据仪器调整）：
    • 在一个预热的比色皿中加入：
      • 适量缓冲液（含DTNB） (注1)
      • 适量待测样本（粗提液，含有适量酶蛋白）（注2）
      • 加入草酰乙酸溶液（启动反应）
    • 用移液枪轻轻混匀。
  4. 启动反应与监测：
    • 将比色皿立即放入已预热至设定温度的分光光度计样品池中。
    • 盖上盖子（防止蒸发）。
    • 开始计时并监测A412值变化（基线期）。
    • 通常基线稳定30秒至1分钟后，加入乙酰辅酶A溶液 (注3)。
    • 立即轻轻混匀（可用移液枪小心吹打数次或在仪器中进行搅拌）。
    • 连续记录A412值随时间（通常2-5分钟）的变化曲线。确保获得稳定的线性反应速率期（通常是最初1-3分钟）。
  5. 对照设置：
    • 空白对照： 用缓冲液代替酶液，其余步骤相同。用于扣除背景吸收（如DTNB缓慢水解等）。
    • 样本自身对照/阴性对照： 可设置不含乙酰辅酶A（用缓冲液代替）的反应体系，用于评估非特异性反应。有时也设置不含草酰乙酸的对照（通常影响较小）。
  6. 终止（可选）： 若不采用连续监测法，可在反应进行到预定时间点时（如2分钟或5分钟），迅速加入强酸终止反应（如0.1倍体积的30%三氯乙酸），静置数分钟，离心去除沉淀，测定上清液在412 nm处的吸光度。此法需设置严格的反应时间点。
  • 注1： 缓冲液（含DTNB）的体积应保证加入所有组分后反应总体积准确（如1 mL）。确保缓冲液在加入底物前已预热至反应温度。
  • 注2： 样本加入量需优化，使反应速率在仪器检测的线性范围内（ΔA412/min 通常在0.02 - 0.15之间）。样本蛋白浓度过低或过高都可能导致误差。
  • 注3： 乙酰辅酶A常被用作启动试剂，因其更稳定。加入顺序可调整（如先加乙酰辅酶A，最后加草酰乙酸启动），但需保证反应只在最后一种底物加入后才开始。

六、 结果计算

  1. 计算反应速率 (ΔA412/min):
    • 在连续监测获得的吸光度-时间曲线上，选择线性最佳的一段（通常是加入乙酰辅酶A后的最初线性部分）。
    • 计算该时间段内吸光度随时间的平均变化速率（斜率），单位是每分钟吸光度变化（ΔA412/min）。
    • 减去空白对照的速率（ΔA412/min空白）。
    • 即： 样品实际反应速率 ν = (ΔA412/min样品 - ΔA412/min空白)
  2. 计算酶活性：
    • 柠檬酸合酶活性通常定义为：在特定反应条件下（温度、pH），每分钟催化产生1 μmol 辅酶A (等于催化1 μmol 底物转化) 所需的酶量。
    • 公式：
酶活性 (μmol/min/mL) = [ (ν * Vᵣ) ] / (ε * d * Vₛ)* `ν`： 样品实际反应速率 (ΔA412/min) * `Vᵣ`： 反应体系总体积 (mL) * `ε`： 还原型TNB (TNB⁻) 在412 nm处的摩尔消光系数 (cm⁻¹M⁻¹)。 **常用值： 13600 M⁻¹cm⁻¹ (在pH 8.0时)。** 需确认所使用缓冲液条件下的确切值（有时文献报告为14150 M⁻¹cm⁻¹）。 (*关键参数*) * `d`： 比色皿光程 (cm)，通常为1 cm。 * `Vₛ`： 加入反应体系中的样本体积 (mL) * **比活性计算：** 为了比较不同样本或纯化步骤中的酶活性，通常计算单位质量蛋白质的酶活性（比活性）。比活性 (μmol/min/mg prot) = 酶活性 (μmol/min/mL) / 样本蛋白浓度 (mg prot/mL)* 样本蛋白浓度需预先测定（如BCA法、Bradford法）。

3. 标准曲线法（可选）： 如果用终止法或需验证ε值，可用已知浓度的GSH替代CoA-SH制作标准曲线（浓度范围覆盖反应产生的TNB⁻浓度），建立A412与巯基摩尔浓度之间的关系。然后根据反应终止时的A412值（扣除空白）和标准曲线计算出生成的CoA-SH量（μmol），再除以反应时间和样本体积（及蛋白浓度）计算活性。

七、 方法学注意事项

  1. 底物浓度： 需确保底物浓度（特别是乙酰辅酶A）在反应体系中是过量的且达到饱和，以使反应速率达到Vmax，反映真实的酶活性。需进行底物浓度优化实验（米氏常数Km测定）。
  2. pH选择： pH 8.0-8.2是柠檬酸合酶的最适pH范围。缓冲液的pH需精确配制和验证。Tris缓冲液在此pH下有效。
  3. 温度控制： 酶活性高度依赖温度。反应温度必须严格控制并明确报告（常用25°C或30°C）。
  4. 样本质量： 样本制备是关键。细胞破裂要彻底，但避免过度处理导致酶失活。线粒体样本需保证完整性或充分裂解释放酶。样本蛋白浓度过低会导致信号弱、误差大；过高则可能超出线性范围或引入抑制剂。
  5. DTNB稳定性： DTNB溶液不稳定，需新鲜配制或小份分装避光保存。其水解产物也会在412 nm有吸收，故空白对照必不可少。
  6. 草酰乙酸稳定性： 草酰乙酸在水中不稳定，会缓慢脱羧生成丙酮酸（可竞争性抑制CS）。必须新鲜配制或使用前解冻新鲜配制。避免反复冻融。
  7. 乙酰辅酶A纯度： 使用高纯度乙酰辅酶A。部分低纯度产品可能含有游离CoA-SH杂质（导致本底高）或抑制剂。
  8. 线性范围： 确保反应初速度的测定在线性期内进行。样本加入量、反应时间需优化。
  9. 干扰因素： 样本中存在的游离硫醇（如GSH、蛋白质巯基）会消耗DTNB导致本底升高。需设置空白对照进行扣除。使用专一性更高的检测方法（如耦合苹果酸脱氢酶法）可减少此类干扰，但操作更复杂。

八、 质量控制

  1. 标准曲线验证： 定期用GSH标准曲线验证DTNB反应的线性和摩尔消光系数ε值。
  2. 阳性对照： 使用已知活性的标准酶样品（如纯化的柠檬酸合酶）进行测试，验证实验体系的有效性和准确性。
  3. 精密度： 进行批内重复和批间重复实验，评估方法的精密度（如CV%）。
  4. 线性验证： 验证酶活性与样本稀释度之间的线性关系。

九、 安全注意事项

  • 草酰乙酸、乙酰辅酶A、DTNB、三氯乙酸（TCA）、高氯酸等试剂具有一定毒性或刺激性。
  • 操作时需佩戴合适的个人防护装备（实验服、手套、护目镜）。
  • 在通风橱内配制和处理挥发性或有毒试剂。
  • 按照实验室安全规范处理废液（特别是含酸废液）。

十、 应用

柠檬酸合酶活性检测广泛应用于以下研究领域：

  1. 线粒体功能研究： 作为线粒体含量的标志物，评估细胞或组织中线粒体的生物发生、数量及完整性。
  2. 细胞代谢研究： 评估细胞的有氧呼吸能力、能量代谢状态（如肿瘤细胞的Warburg效应研究）。
  3. 生理与病理研究： 研究运动生理学（骨骼肌适应）、衰老、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）、代谢性疾病（如糖尿病、肥胖症）、心血管疾病等中线粒体功能的变化。
  4. 毒理学研究： 评估环境毒素或药物对线粒体功能的损伤。
  5. 植物生理与胁迫响应： 研究植物能量代谢及对环境胁迫（如干旱、低温、重金属）的响应。
  6. 微生物代谢工程： 研究微生物（如酵母、细菌）中TCA循环通量。

总结

本方法详细描述了基于DTNB比色法的柠檬酸合酶活性检测原理、试剂配制、样本处理、操作步骤、结果计算及关键注意事项。该方法具有操作相对简便、灵敏度适中、成本较低等优点，是研究线粒体功能和细胞能量代谢的常用工具。成功应用的关键在于严格的实验条件控制（温度、pH）、高质量的试剂与样本制备、准确的动力学数据采集以及合理的数据处理。