抗坏血酸过氧化物酶（APX）测定

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定方法详解

一、 前言

抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX， EC 1.11.1.11)是植物抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH循环)中的关键酶，也是清除活性氧（尤其是H₂O₂）的核心酶之一。它在植物抵抗氧化胁迫（如干旱、盐碱、低温、高温、重金属胁迫、病原菌侵染等）过程中发挥着至关重要的作用。准确测定APX活性对于研究植物的抗氧化能力、生理状态和各种胁迫响应机制具有重要意义。

二、 测定原理

APX催化的核心反应是利用抗坏血酸(AsA)作为特异性的电子供体，还原过氧化氢(H₂O₂)生成水(H₂O)，同时抗坏血酸被氧化成单脱氢抗坏血酸(MDHA)。

反应式： H₂O₂ + 2 抗坏血酸 (AsA) → 2 H₂O + 2 单脱氢抗坏血酸 (MDHA)

在反应过程中，还原型抗坏血酸(AsA)在波长290 nm处具有特征吸收峰。随着反应的进行，AsA不断被消耗，其在290 nm处的吸光度(A₂₉₀)随之下降。通过监测单位时间内A₂₉₀的降低值（ΔA₂₉₀ / min），并利用抗坏血酸的摩尔消光系数(ε₂₉₀ = 2.8 mM⁻¹ cm⁻¹)，即可计算出APX的酶活性。

三、 主要试剂与材料

  • 提取缓冲液 (预冷)：
    • 50 mM 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0, 含0.1 mM EDTA)：提供适宜pH环境，EDTA螯合金属离子抑制其他酶活性。
    • 1 mM AsA：保护APX活性，防止提取过程中失活。
    • 1% (w/v) 聚乙烯聚吡咯烷酮：去除酚类化合物干扰。
    • （可选）1 mM 苯甲基磺酰氟：抑制蛋白酶活性。
  • 反应缓冲液 (临用前配制)：
    • 50 mM 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0)
    • 0.1 mM EDTA
    • 0.5 mM AsA：作为反应底物。需新鲜配制或临用前加入。
  • 反应启动液：
    • 0.1 mM H₂O₂：反应的另一底物。用磷酸钾缓冲液(pH 7.0)新鲜稀释30% H₂O₂储备液得到。浓度需用分光光度法准确标定（ε₂₄₀ = 43.6 M⁻¹ cm⁻¹）。
  • 标准品：
    • 抗坏血酸标准溶液：用于验证吸光系数或制作标准曲线（可选）。
  • 其他：
    • 液氮：用于快速冷冻样品。
    • 预冷的研钵和研杵或组织研磨仪。
    • 冷冻离心机。
    • 紫外/可见分光光度计（带恒温比色槽）。
    • 石英比色皿（光径1 cm）。
    • 微量移液器及配套吸头。
    • 计时器。
    • 冰盒。

四、 实验步骤

  1. 样品制备 (全程冰上操作)：

    • 准确称取新鲜植物组织（叶片、根系等，通常0.1 - 0.5 g），迅速放入预冷的研钵中，加入少量液氮快速研磨成细粉。
    • 加入适量预冷的提取缓冲液（推荐比例：1 g鲜重：5-10 ml缓冲液），在冰浴中充分研磨匀浆。
    • 将匀浆液转移至预冷的离心管中，于4°C下，12000 - 15000 g离心15-20分钟。
    • 小心吸取上清液（即粗酶提取液），置于冰上备用。此步骤需尽快完成，避免酶失活。上清液可分装冻存于-80°C（但新鲜测定活性最佳）。

  2. 酶活性测定 (连续监测法)：

    • 预热分光光度计至25°C（或实验设定温度）。
    • 在干净的1 cm光径石英比色皿中，依次加入：
      • 1.7 ml 反应缓冲液 (含50 mM 磷酸钾缓冲液pH 7.0、0.1 mM EDTA、0.5 mM AsA)
      • 0.1 ml 粗酶提取液 (根据酶活性高低可适当调整体积，如0.05 - 0.2 ml，需保证反应初始ΔA₂₉₀/min在0.02-0.2之间线性良好。若酶活性过高，需用提取缓冲液稀释提取液)
    • 轻微混匀（避免气泡），将比色皿放入分光光度计中，设定波长290 nm。
    • 平衡1-2分钟，记录初始吸光度(A₀)。
    • 启动反应： 快速加入0.2 ml 新鲜配制的0.1 mM H₂O₂溶液，立即轻轻颠倒混匀（或使用移液器吹打混匀），并同时启动计时器。
    • 立即将比色皿放回光度计，连续监测290 nm处吸光度下降值，持续2-3分钟，记录时间-吸光度曲线（或每隔15-30秒记录一次吸光度值，至少记录6-8个点）。确保反应起始阶段的线性变化良好。
    • 空白对照： 设立两个空白对照，以扣除非酶促反应背景。
      • 空白1 (酶空白)： 用等体积的提取缓冲液代替粗酶提取液，其余步骤相同。用于校正提取液中可能存在的干扰物质。
      • 空白2 (底物空白)： 用等体积的反应缓冲液代替H₂O₂溶液启动反应，其余步骤相同。用于校正AsA的非酶氧化或酶提取液中可能存在的APX以外的消耗AsA的活性。

  3. 数据记录：

    • 准确记录反应时间(t, 分钟)和对应的吸光度值(A₂₉₀)。
    • 计算每个时间点的ΔA₂₉₀ = (A_t - A₀)，制作ΔA₂₉₀与时间(t)的关系图。
    • 选取反应线性变化阶段（通常为反应开始后的最初90-180秒），计算单位时间内的吸光度变化值：ΔA₂₉₀ / min = (ΔA₂₉₀₂ - ΔA₂₉₀₁) / (t₂ - t₁)

五、 结果计算

  1. 计算样品反应速率：
    • 样品反应的ΔA₂₉₀/min (样品) = (ΔA₂₉₀/min) 观测值
  2. 计算空白反应速率：
    • 空白1 (酶空白)反应的ΔA₂₉₀/min (空白1)
    • 空白2 (底物空白)反应的ΔA₂₉₀/min (空白2)
  3. 校正反应速率：
    • 校正后的 ΔA₂₉₀/min = ΔA₂₉₀/min (样品) - [ΔA₂₉₀/min (空白1) + ΔA₂₉₀/min (空白2)]
    • 此步骤至关重要，用于扣除非APX导致的吸光度下降。
  4. 计算酶活性 (单位定义)：

    • APX活性通常定义为：在特定温度（如25°C）和pH（7.0）条件下，每分钟催化氧化1 μmol抗坏血酸(AsA)所需的酶量。

    • 公式： APX活性 (μmol min⁻¹ mg⁻¹ prot) = [ (ΔA₂₉₀/min) * V_total ] / (ε * d * V_enzyme * C_protein)

    • 其中：

      • ΔA₂₉₀/min：校正后的每分钟吸光度下降值。
      • V_total：反应体系总体积（单位：ml）。本例中为 1.7 ml + 0.1 ml + 0.2 ml = 2.0 ml。
      • ε：抗坏血酸在290 nm处的摩尔消光系数，为 2.8 mM⁻¹ cm⁻¹ (即 2.8 * 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹)。
      • d：比色皿光径（单位：cm）。通常为1 cm。
      • V_enzyme：反应体系中加入的粗酶提取液体积（单位：ml）。本例中为0.1 ml。
      • C_protein：粗酶提取液中蛋白质浓度（单位：mg ml⁻¹）。需用Bradford法、Lowry法或BCA法等方法单独测定。

    • 简化公式： APX活性 (μmol min⁻¹ mg⁻¹ prot) = (ΔA₂₉₀/min * 2.0) / (2.8 * 1 * 0.1 * C_protein) = (ΔA₂₉₀/min * 2.0) / (0.28 * C_protein) = (ΔA₂₉₀/min * 7.143) / C_protein

    • 单位说明：

      • 结果也可表示为 μmol min⁻¹ g⁻¹ FW（每克鲜重组织每分钟），此时公式中C_protein需替换为用于提取的每毫升缓冲液对应的组织鲜重(g ml⁻¹)。即： APX活性 (μmol min⁻¹ g⁻¹ FW) = [ (ΔA₂₉₀/min) * V_total ] / (ε * d * V_enzyme * (W_fresh / V_extract)) W_fresh：提取所用组织鲜重(g) V_extract：提取所用缓冲液总体积(ml)

六、 关键注意事项

  1. 低温操作： APX对热非常敏感，整个提取和测定过程需在冰浴或4°C冷室中进行。
  2. 保护APX： 提取缓冲液中必须包含AsA（通常1 mM）以维持APX的还原状态，防止提取过程中失活。EDTA（0.1-1 mM）用于螯合金属离子，抑制依赖金属离子的其他氧化酶活性。
  3. 底物稳定性： AsA溶液和H₂O₂溶液均不稳定，需新鲜配制（特别是H₂O₂工作液），并在冰上避光保存。H₂O₂浓度必须准确标定。
  4. 反应线性： 确保酶促反应在测量时间段内呈线性（ΔA₂₉₀ ~时间图应为直线）。如果ΔA₂₉₀/min过高（>0.2/min）或过低（<0.02/min），应相应稀释或增加酶液量。
  5. 精确计时与混匀： 加入H₂O₂启动反应后，需立即彻底混匀并开始计时读数，以保证测量起始点准确。
  6. 排除干扰：
    • 酚类物质： 植物组织（特别是富含酚类的组织）中的酚类化合物容易氧化并干扰290 nm测定。在提取缓冲液中添加聚乙烯聚吡咯烷酮可有效吸附酚类杂质。
    • 非酶消耗AsA： 设立空白对照至关重要，以扣除非APX引起的AsA氧化（如金属离子催化氧化）。
    • 其它酶： 高浓度的H₂O₂可能激活过氧化物酶或诱导AsA的非酶氧化。使用低浓度H₂O₂（0.1-1 mM）有助于特异性检测APX。EDTA也能抑制部分依赖于金属离子的过氧化物酶。
  7. 蛋白质浓度： 粗酶液中蛋白质浓度的准确测定是计算比活的基础。
  8. 样本处理： 尽量使用新鲜样本，避免反复冻融。若需保存，速冻后置于-80°C，并尽快测定。
  9. 石英比色皿： 必须使用石英比色皿，普通玻璃比色皿在290 nm处有强吸收。
  10. 酶活性单位： 明确报告所使用的酶活性单位定义（如基于蛋白含量μmol min⁻¹ mg⁻¹ prot或基于组织鲜重μmol min⁻¹ g⁻¹ FW）以及测定温度。

七、 总结

本方法基于APX催化AsA还原H₂O₂导致290 nm吸光度下降的原理，通过连续监测法准确测定APX活性。关键在于严格的低温操作、添加保护剂（AsA、EDTA）、排除干扰（酚类、空白对照）、使用新鲜配制的不稳定底物以及确保反应初速度在线性范围内。通过规范的操作流程和严谨的数据处理，该方法能够可靠地反映植物组织中APX的活性水平，为研究植物的氧化胁迫响应和抗氧化能力提供重要依据。

主要参考文献：

  • Nakano, Y., & Asada, K. (1981). Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant and Cell Physiology, 22(5), 867-880. (经典原始文献，确立原理)
  • Chen, G. X., & Asada, K. (1989). Ascorbate peroxidase in tea leaves: occurrence of two isozymes and the differences in their enzymatic and molecular properties. Plant and Cell Physiology, 30(7), 987-998.
  • 李合生 等. (主编). (2000). 植物生理生化实验原理和技术. 高等教育出版社. (国内常用参考书)
  • 具体实验方法细节可参考权威期刊（Plant Physiology, Plant Journal, Plant Cell and Environment, Physiologia Plantarum, Journal of Experimental Botany等）上相关研究论文的方法部分。