抗坏血酸氧化酶（AAO）测定

抗坏血酸氧化酶（AAO）活性测定方法

一、 引言 抗坏血酸氧化酶（Ascorbate Oxidase, AAO, EC 1.10.3.3）是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于植物组织中，尤其在黄瓜、南瓜等葫芦科植物中活性较高。AAO 催化抗坏血酸（Ascorbic Acid, AsA）与氧分子反应，生成脱氢抗坏血酸（Dehydroascorbic Acid, DHA）和水。该酶在植物生长发育、抗逆反应（如抵御病原菌入侵）以及采后果蔬的衰老和褐变过程中扮演重要角色。因此，准确测定 AAO 活性对于植物生理学、病理学及采后生物学研究具有重要意义。本方法描述了基于紫外分光光度法测定 AAO 活性的标准流程。

二、 测定原理 AAO 催化以下反应：

在该反应中，还原型的抗坏血酸（AsA）被氧化成氧化型的脱氢抗坏血酸（DHA）。AsA 在波长 265-290 nm（通常在 265 nm 或 290 nm）具有特征性吸收峰，而 DHA 在此波长范围内的吸收很弱或无吸收。因此，随着酶促反应的进行，反应体系中 AsA 的浓度逐渐降低，其在特定紫外波长下的吸光度值（OD值）也随之下降。通过测定单位时间内反应体系在选定波长下吸光度的降低值（ΔOD/min），即可计算出 AAO 的酶活力。吸光度下降的速率与酶活性成正比。

三、 试剂与材料

1. 磷酸盐缓冲液（pH 5.8 - 6.0, 0.1 M）： 称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和磷酸二氢钠（NaH₂PO₄），按比例溶解于双蒸水中，用 pH 计精确调节 pH 至 5.8 或 6.0（此 pH 接近 AAO 最适 pH），定容至所需体积。4℃保存。
2. 底物溶液（0.1 M L-抗坏血酸）： 精确称取 L-抗坏血酸粉末，用预冷的 0.1 M 磷酸盐缓冲液(pH 5.8-6.0)溶解并定容。此溶液必须现用现配，并在冰浴中避光保存，因 AsA 在水溶液中和空气中极易被氧化。
3. 酶提取液（通常含保护剂）：
   • 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0 - 7.8, 接近中性以稳定酶活)。
   • 1-2 mM 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）：螯合金属离子，抑制金属蛋白酶。
   • 1-5% (w/v) 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或 1-5% (w/v) 聚乙二醇（PEG）：吸附酚类物质，防止其干扰。
   • 1-10 mM 二硫苏糖醇（DTT）或 1-5 mM 还原型谷胱甘肽（GSH）：提供还原环境，保护酶和底物（可选，需根据样本类型优化）。
   • 注： 具体提取液成分需根据样本特性（如酚类、醌类物质含量）进行优化。配制后 4℃ 保存。
4. 终止液（1 M 盐酸）： 浓盐酸用双蒸水稀释。使用时注意安全（通风橱操作，防护眼镜、手套）。
5. 石英比色皿： 用于紫外光区（265 nm 或 290 nm）吸光度测定。普通玻璃比色皿在此波长下吸收强，不可使用。
6. 离心机及离心管
7. 研钵或组织研磨器（预冷）
8. 冰浴装置
9. 紫外可见分光光度计
10. 移液器及枪头
11. 计时器

四、 实验步骤

1. 酶液提取（全程冰浴操作）：

   1. 取新鲜植物组织（如叶片、果实），迅速称取适量（如 0.5 - 2.0 g），放入预冷的研钵中。
   2. 加入适量预冷的酶提取液（体积通常为组织重的 2-5 倍，如 1g 组织加 4ml 提取液）和少量石英砂或PVPP。
   3. 在冰浴中充分研磨成匀浆。
   4. 将匀浆液转移至预冷的离心管中，4℃下高速离心（如 12,000 - 15,000 g，15 - 30 分钟）。
   5. 小心吸取上清液，此即为酶粗提液（Crude Enzyme Extract）。立即置于冰上备用或用于下一步测定。如需保存，应分装后置于 -20℃ 或 -80℃（长期保存）。

2. 反应体系建立与测定：

   • 反应总体积： 通常为 1 ml 或 3 ml（根据比色皿规格调整）。
   • 空白对照管（Blank）： 用于校正非酶氧化造成的吸光度下降。
     • 磷酸盐缓冲液(pH 5.8-6.0)： 适量体积（如 2.75 ml for 3ml 体系）。
     • 底物溶液（0.1 M AsA）： 0.25 ml。
     • 酶液： 0 ml (用等体积缓冲液代替)。
     • 启动顺序： 将缓冲液和底物在比色皿中预混，放入分光光度计样品池中预热（如 25℃ 或 30℃）平衡 2-3 分钟。记录初始吸光度（A₀），然后立即加入用于替代酶液的缓冲液（体积与测定管酶液体积相同，如 0.05 ml），迅速混匀，同时启动计时器。
   • 测定管（Sample）：
     • 磷酸盐缓冲液(pH 5.8-6.0)： 适量体积（如 2.75 ml for 3ml 体系）。
     • 底物溶液（0.1 M AsA）： 0.25 ml。
     • 酶液： 适量体积（如 0.05 ml，需根据酶活力高低调整，使 ΔOD/min 在 0.05 - 0.2 范围内为宜）。
     • 启动顺序： 将缓冲液和底物在比色皿中预混，放入分光光度计样品池中预热（温度需与空白管一致，如 25℃ 或 30℃）平衡 2-3 分钟。记录初始吸光度（A₀），然后立即加入酶液，迅速混匀（如用封口膜盖住管口倒置混匀或使用比色皿专用搅拌子），同时启动计时器。
   • 测定： 在选定波长（265 nm 或 290 nm）下，立即开始连续测定吸光度值（A），每隔 30 秒或 1 分钟记录一次数据，持续 3 - 5 分钟（或直到吸光度下降趋势明显线性）。

3. 终止反应（可选）： 如果采用固定时间终点法而非连续监测法，则在反应进行到预定时间（如 3 分钟）时，立即加入一定体积（如 0.1 ml）的 1 M 盐酸终止反应。然后测量终止后反应液的吸光度（A_t）。

五、 结果计算

1. 连续监测法（推荐）：

   • 分别作空白管和测定管的吸光度（A）随时间（t）变化的曲线。
   • 选取反应初速度阶段（吸光度下降线性良好的时间段，通常前 1-3 分钟），计算测定管吸光度随时间下降的斜率（ΔOD_sample / min）和空白管吸光度随时间下降的斜率（ΔOD_blank / min）。
   • 酶促反应速率（ΔOD/min）： ΔOD/min = |(ΔOD_sample / min) - (ΔOD_blank / min)| (取绝对值)
   • AAO 酶活力单位（U）定义： 在上述测定条件下（指定温度、pH），每分钟催化氧化 1 μmol 抗坏血酸（AsA）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
   • 计算： AAO 活性 (U/g FW or U/mg prot) = (ΔOD/min × V_t × D) / (ε × d × v_e × t × W)
     • ΔOD/min： 酶促反应速率（吸光度下降值/分钟）。
     • V_t： 反应体系总体积（ml）。
     • D： 酶液在测定前的稀释倍数（若酶液直接上样则 D=1；若上清液为粗酶液且未经稀释，则 D=提取液体积(g)/组织鲜重(ml)，例如 1g组织加4ml缓冲液提取，则 D=4）。
     • ε： 抗坏血酸在测定波长下的摩尔消光系数（M⁻¹cm⁻¹）。
       • 265 nm: ε ≈ 14, 300 M⁻¹cm⁻¹ (最常用)
       • 290 nm: ε ≈ 2, 800 M⁻¹cm⁻¹ (干扰较少)
     • d： 比色皿光程（cm），通常为 1 cm。
     • v_e： 测定反应体系中加入的酶液体积（ml）。
     • t： 时间单位换算因子，此处 t=1 分钟（因为 ΔOD/min 已是每分钟变化）。
     • W： 酶活力表示的基础。
       • g FW： 每克鲜重组织（Fresh Weight）。此时 W = 用于提取酶的组织鲜重（g）。
       • mg prot： 每毫克蛋白。此时需要额外测定酶提取液中可溶性蛋白浓度（如 Bradford 法），用蛋白浓度代替 W。公式变为： AAO 活性 (U/mg prot) = (ΔOD/min × V_t × D) / (ε × d × v_e × t × C_p) C_p 为测定反应体系中加入的酶液所含的蛋白浓度（mg/ml）。实际计算时，通常是先算出反应体系中的总活力，再除以加入的蛋白总量（C_p * v_e）。

2. 固定时间法（终点法）：

   • AAO 活性 (U/g FW or U/mg prot) = [(A₀_sample - A_t_sample) - (A₀_blank - A_t_blank)] × V_t × D / (ε × d × v_e × t × W)
     • A₀_sample, A_t_sample： 测定管的初始（0 min）和终止时（t min）吸光度。
     • A₀_blank, A_t_blank： 空白管的初始（0 min）和终止时（t min）吸光度。
     • t： 反应时间（分钟）。
     • 其他符号含义同上。

六、 注意事项

1. 低温操作： 样品处理、匀浆、离心及酶液保存均需在 0-4℃ 冰浴中进行，防止酶失活。
2. 底物稳定性： L-抗坏血酸溶液极易被空气氧化，务必现用现配，配制和保存（冰浴避光）操作要迅速。
3. 反应启动与计时： 加入酶液启动反应的操作要快而准确，并立即开始计时和记录吸光度。
4. 波长选择： 265 nm 灵敏度最高，但干扰物质可能较多；290 nm 灵敏度较低，但干扰较少。需根据样本情况选择。使用石英比色皿。
5. 酶液浓度： 应调整加入酶液的体积或稀释浓度，使反应初速度阶段吸光度下降速率（ΔOD/min）在 0.05 - 0.2 之间，以保证测定在线性范围内。
6. 温度控制： 反应体系温度（分光光度计样品池温度）需精确控制并保持恒定（常用 25℃ 或 30℃）。
7. 空白对照： 必须设置空白对照以扣除抗坏血酸非酶氧化造成的吸光度下降。
8. pH 值： 磷酸盐缓冲液的 pH 值必须精确，它显著影响酶活性。
9. 样本均一性： 植物组织取样需具有代表性，并快速处理。
10. 安全： 操作浓盐酸时务必在通风橱中，穿戴防护眼镜和手套。
11. 数据分析： 确保使用反应初速度阶段的线性部分进行计算。

七、 应用 本方法适用于：

• 研究不同植物种类、器官、发育阶段或环境胁迫（干旱、盐碱、低温、病害等）下 AAO 活性的变化。
• 评估采后果蔬贮藏保鲜过程中 AAO 活性与褐变、衰老的关系。
• 筛选低 AAO 活性的育种材料。
• 生化研究中 AAO 酶学性质（最适 pH、最适温度、动力学参数 Km/Vmax、抑制剂/激活剂效应等）的分析。

通过严格遵守上述操作规程和注意事项，可获得准确、可靠、可重复的抗坏血酸氧化酶（AAO）活性数据。