氧化型/脱氢抗坏血酸（DHA）含量测定

氧化型抗坏血酸（DHA）含量测定指南

一、 概述

氧化型抗坏血酸（Dehydroascorbic Acid, DHA），是维生素C（抗坏血酸，AA）的氧化形式。虽然其本身不具备直接的维生素C生物活性，但在生物体内，DHA可以被还原酶系统（如谷氧还蛋白系统）还原回具有活性的抗坏血酸。因此，测定样品中DHA的含量对于全面评估维生素C的状态、研究氧化还原平衡、评估样品新鲜度（尤其在食品中）以及研究相关生理病理过程具有重要意义。

二、 测定原理

由于DHA本身缺乏强发色团或荧光基团，难以直接测定，其含量通常通过间接法进行测定。核心思路是：

1. 测定总抗坏血酸（Total Ascorbic Acid, TAA）含量： 指样品中所有形式的维生素C（包括还原型的AA和氧化型的DHA）的总和。
2. 测定还原型抗坏血酸（Reduced Ascorbic Acid, AA）含量。
3. 计算DHA含量： DHA含量 = TAA含量 - AA含量

因此，DHA测定的关键在于选择合适的、能分别准确测定TAA和AA的方法。

三、 常用测定方法

以下介绍几种常用且经典的测定方法。选择哪种方法取决于样品类型、实验室设备、精度要求和通量需求。

1. 2,4-二硝基苯肼比色法

   • 原理：
     • 测定TAA： 首先用还原剂（如二硫苏糖醇DTT、三(2-羧乙基)膦TCEP或半胱氨酸）将样品中所有的DHA还原为AA，使TAA全部以AA形式存在。然后，AA在酸性条件下（通常用偏磷酸或三氯乙酸处理以沉淀蛋白）与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应，生成红色的2,4-二硝基苯腙衍生物（脎）。此衍生物在硫酸溶液中显稳定的棕红色，在特定波长（通常约520-550nm）有最大吸收，可用分光光度计定量。
     • 测定AA： 另取一份未经还原剂处理的样品，直接与DNPH反应。此时只有样品中原本存在的AA能反应生成衍生物。
     • 计算DHA： DHA = TAA - AA
   • 特点：
     • 优点：仪器要求相对简单（只需分光光度计），成本较低，应用广泛，尤其适合食品、植物组织等基质。
     • 缺点：操作步骤较多（还原、酸化、衍生、比色），耗时较长；DNPH有一定毒性；样品颜色或杂质可能干扰比色；反应条件（反应时间、温度、酸度）需严格控制以保证重现性。

2. 高效液相色谱法（HPLC）

   • 原理：
     • 直接测定AA： 通常采用反相色谱柱（如C18柱），以酸性水溶液（如磷酸盐缓冲液、甲酸溶液）或含少量离子对试剂（如十六烷基三甲基溴化铵）的缓冲液为流动相，配合紫外检测器（通常在波长243-265nm附近AA有吸收）或电化学检测器（ECD，灵敏度高、选择性好）直接分离并定量样品提取液中的AA。
     • 测定TAA： 需要先将样品提取液用还原剂（如DTT、TCEP）处理，将DHA完全还原为AA，然后同样用HPLC测定此时的AA总量（即TAA）。
     • 计算DHA： DHA = TAA - AA
     • 或 直接测定DHA： 部分方法会添加邻苯二胺（OPDA）等衍生化试剂，使DHA特异地转化为具有强荧光的喹喔啉衍生物，然后用HPLC配合荧光检测器分离测定DHA。此时需同时测定AA（通常用紫外或ECD），再计算TAA (TAA = AA + DHA)。
   • 特点：
     • 优点：灵敏度高、特异性好、准确性高；可同时或分别测定AA和DHA（尤其当使用衍生化或双检测器时）；抗干扰能力强，适合复杂基质（如生物体液、组织匀浆液）；通量相对较高。
     • 缺点：仪器昂贵；需要一定的色谱操作技术和经验；流动相和色谱柱维护成本较高。

3. 酶法（偶联酶反应法）

   • 原理：
     • 测定AA： 利用抗坏血酸氧化酶（Ascorbate Oxidase, AO）特异性地氧化AA生成DHA和水，同时消耗氧气。可通过氧气电极（氧耗法）或伴随的氧化还原指示反应（如2,6-二氯酚靛酚DCPIP还原褪色法，在特定波长如520 nm或600 nm测定吸光度下降）来定量AA。
     • 测定TAA： 先用还原剂（常用DTT）将样品中的DHA还原为AA，然后再用上述酶法测定总还原力（即TAA）。
     • 计算DHA： DHA = TAA - AA
   • 特点：
     • 优点：特异性极高（酶促反应）；操作相对简便快速（尤其试剂盒形式）；适合血清、血浆等临床样本和部分食品样品。
     • 缺点：酶试剂通常成本较高；氧气电极法仪器特殊；DCPIP法需严格控制反应条件；可能受样品中其他还原性物质干扰（但酶的特异性通常会降低干扰）。

四、 实验步骤（通用流程概述）

虽然具体步骤因所选方法和试剂不同而差异很大，但一般包含以下关键环节：

1. 样品采集与保存：
   • 维生素C（尤其AA）极不稳定，易被空气氧化、光解、热分解和酶促氧化。
   • 采集后应立即处理或迅速冷冻（-70℃或液氮）。
   • 提取前避免反复冻融。
   • 生物样本（血液、组织）通常需要快速加入含蛋白质沉淀剂（如偏磷酸、三氯乙酸、高氯酸）和金属螯合剂（如EDTA）的预冷提取液中，以稳定维生素C、沉淀蛋白并抑制酶活性。
   • 食品样品需匀浆后用含稳定剂的酸性溶剂提取（如偏磷酸-乙酸溶液）。
2. 样品提取：
   • 在低温（冰浴）下进行。
   • 使用含有稳定剂（如偏磷酸、草酸、EDTA）的酸性提取液（常用1-5%偏磷酸或三氯乙酸溶液），以防止提取过程中AA的氧化。提取液pH通常控制在1.0-3.0。
   • 充分匀浆或振荡提取后，高速离心取上清液。上清液可能需要进一步过滤或稀释。
3. 还原步骤（测定TAA时必需）：
   • 取适量样品提取液，加入适量还原剂溶液（如DTT或TCEP溶液）。
   • 室温或37℃孵育一定时间（通常10-60分钟），确保DHA完全还原为AA。
   • 还原后需立即进行后续测定，或加入酸性稳定剂终止反应并保存。
4. AA测定：
   • 按照选定的方法（分光光度法、HPLC法、酶法）的详细操作步骤，测定原始样品提取液（未还原） 中的AA含量。
5. TAA测定：
   • 按照选定的方法（分光光度法、HPLC法、酶法）的详细操作步骤，测定经还原剂处理后的样品提取液 中的AA含量（该值即代表TAA）。
6. DHA计算：
   • 使用公式: DHA含量 = TAA含量 - AA含量
   • 结果通常以每克鲜重（或干重）、每毫升样品、每毫克蛋白等形式表示（例如 μg/g, mg/100g, nmol/mL, nmol/mg protein）。注意单位统一。

五、 注意事项

1. 防止氧化降解： 这是实验成败的关键！整个实验过程（从采样到测定）必须快速、避光、低温（冰浴操作） 。提取液和试剂需新鲜配制或妥善保存（如提取液可预先冷冻成小份）。
2. 试剂纯度与配制： 使用高纯度试剂（尤其是还原剂、衍生试剂、色谱纯试剂）和超纯水。严格按照方法要求配制溶液，注意pH值。
3. 空白与对照： 必须设置合适的试剂空白（所有试剂，不加样品）、样品空白（样品，不加关键反应试剂如DNPH或酶）和质控样品（如已知浓度的AA/DHA标准品），以扣除背景干扰、监控反应效率和评估方法准确性、精密度。
4. 标准曲线： 每次测定都应使用新鲜配制的抗坏血酸（AA）标准溶液绘制标准曲线。标准溶液需用含稳定剂的酸性溶液配制并避光冷藏保存，临用前稀释。
5. 基质效应： 不同样品基质（如血浆、果汁、蔬菜）可能干扰测定。应优化提取方法，必要时进行样品稀释或采用标准加入法验证回收率。
6. 方法验证： 对于建立的测定方法，应评估其线性范围、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、精密度（日内、日间）、准确度（回收率实验）等参数。
7. 方法选择： 根据实际需求权衡。常规大批量食品分析可选2,4-二硝基苯肼法；对精度和抗干扰要求高，或需同时测定多种物质的复杂生物样本优选HPLC法（尤其带ECD或荧光检测）；追求快速、特异的临床检测可考虑酶法试剂盒。
8. 数据处理： 确保从原始数据（如吸光度值、峰面积）到最终浓度计算过程准确无误，考虑稀释倍数等因素。
9. 安全防护： 实验中可能使用腐蚀性酸（偏磷酸、三氯乙酸、硫酸）、有毒试剂（DNPH）或有刺激性化学品，操作时应佩戴防护眼镜、手套，在通风橱内进行。

六、 结论

准确测定氧化型抗坏血酸（DHA）含量对于深入了解维生素C的代谢、机体抗氧化状态以及评估食品品质等至关重要。通过合理选择并严格操作基于“总抗坏血酸（TAA）减去还原型抗坏血酸（AA）”的间接测定策略（如经典的2,4-二硝基苯肼法、灵敏特异的HPLC法、简便快速的酶法），结合贯穿始终的防降解措施和严格的质量控制，可以在各类样品中获得可靠的结果。掌握方法的原理、关键步骤和注意事项是成功进行DHA含量分析的基础。

参考文献（格式仅供参考）：

1. Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. Current Edition. Specific methods for ascorbic acid/dehydroascorbic acid in various matrices (e.g., Foods, Juices, Pharmaceuticals).
2. Roe, J. H., & Kuether, C. A. (1943). The determination of ascorbic acid in whole blood and urine through the 2,4-dinitrophenylhydrazine derivative of dehydroascorbic acid. Journal of Biological Chemistry, 147(2), 399-407. (Classic DNPH method)
3. Deutsch, J. C. (1998). Dehydroascorbic acid. Journal of Chromatography A, 802(2), 331-337. (Review on HPLC methods)
4. Lykkesfeldt, J. (2000). Determination of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in biological samples by high-performance liquid chromatography using subtraction methods: Reliable reduction with tris[2-carboxyethyl]phosphine hydrochloride. Analytical Biochemistry, 282(1), 89-93. (HPLC with TCEP reduction)
5. Standard Methods for the Examination of Food and Beverages. Current Edition. Relevant chapters on Vitamin C analysis.