硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）测定

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

硫氧还蛋白过氧化物酶（Thioredoxin Peroxidase, TPX）活性测定完整方案

一、目的 测定组织、细胞或体液样品中硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）的催化活性。TPX是重要的抗氧化酶，在清除过氧化氢（H₂O₂）、有机氢过氧化物（如t-BOOH）以及调控细胞氧化还原信号中发挥核心作用。其活性水平常作为氧化应激状态、抗氧化能力及某些疾病进程的生物标志物。

二、测定原理 本方法基于经典的 NADPH 偶联动力学测定法，是目前公认且应用最广泛的 TPX 活性检测方法。其核心步骤依赖于完整的硫氧还蛋白系统：

  1. TPX 催化反应：

    TPX (Peroxiredoxin) + ROOH（过氧化物底物，如 H₂O₂ 或 t-BOOH） → TPX-S₂（氧化型） + ROH（醇或水）

  2. 硫氧还蛋白还原TPX：

    TPX-S₂（氧化型） + Thioredoxin-(SH)₂（还原型硫氧还蛋白） → TPX-(SH)₂（还原型） + Thioredoxin-S₂（氧化型硫氧还蛋白）

  3. 硫氧还蛋白还原酶还原硫氧还蛋白（核心监测步骤）：

    Thioredoxin-S₂（氧化型） + NADPH + H⁺ --(TrxR, Thioredoxin Reductase)→ Thioredoxin-(SH)₂（还原型） + NADP⁺

NADPH 在 340 nm 波长处具有特征性吸收峰。随着反应的进行，NADPH 被消耗，其吸光度（A₃₄₀）随时间下降。通过监测单位时间内 A₃₄₀ 的降低速率（ΔA/min），可以计算出 NADPH 的消耗速率，该速率与 TPX 的催化活性成正比。

三、主要试剂与材料

  1. 缓冲液：

    • 反应缓冲液 (1x)： 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA。 (4°C 储存)
    • 样品匀浆/裂解缓冲液 (1x)： 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1% (v/v) Triton X-100（或 NP-40）。可添加蛋白酶抑制剂混合物（如 PMSF、Leupeptin、Aprotinin 等）。 (现配现用或分装冻存于 -20°C/-80°C)。

  2. 酶促反应体系组分：

    • 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)： 10 mM (溶于 10 mM Tris-HCl, pH 7.5)。 (分装避光冻存于 -20°C/-80°C，避免反复冻融)。
    • 硫氧还蛋白还原酶 (TrxR)： ≥ 5 U/mL (溶于反应缓冲液或甘油)。 (分装冻存于 -20°C/-80°C)。
    • 还原型硫氧还蛋白 (Trx-(SH)₂)： ≥ 10 µM (溶于反应缓冲液)。 (分装冻存于 -20°C/-80°C)。
    • 还原型谷胱甘肽 (GSH)： 1 mM (溶于超纯水)。 (新鲜配制)。
    • 过氧化物底物：
      • 过氧化氢 (H₂O₂)： 工作浓度通常为 100 - 500 µM (由 30% 储备液新鲜稀释于超纯水，浓度需精确测定)。
      • 或 叔丁基过氧化氢 (t-BOOH)： 工作浓度通常为 500 µM - 1 mM (溶于无水乙醇或超纯水)。 (新鲜稀释)。
    • 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB, Ellman's试剂)： 10 mM (溶于无水乙醇或甲醇)。 (避光储存于 4°C)。

  3. 其他：

    • 超纯水 (电阻率 ≥ 18.2 MΩ·cm)。
    • 冰。
    • 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。
    • 考马斯亮蓝蛋白定量试剂或 BCA 蛋白定量试剂。

  4. 仪器设备：

    • 紫外-可见分光光度计 (带恒温比色皿架)。
    • 精密移液器及配套吸头。
    • 微量石英或塑料比色皿 (光径 1 cm)。
    • 低温高速离心机。
    • 涡旋振荡器。
    • 冰浴。
    • pH 计。
    • -20°C / -80°C 冰箱。

四、实验步骤

  1. 样品制备：

    • 组织样品： 用预冷的 PBS 冲洗，吸干，精确称重。加入适量预冷的匀浆缓冲液（如 1:5 w/v），冰浴下充分匀浆。4°C, 10,000 - 15,000 g 离心 15-20 分钟。取上清液（即含酶样品），置于冰上备用。尽快测定或分装冻存于 -80°C。
    • 细胞样品： 用预冷 PBS 洗涤细胞数次，离心收集细胞沉淀。加入适量预冷的裂解缓冲液（如 50-100 µL / 10⁶ 细胞），冰浴裂解 15-30 分钟（可间断涡旋）。4°C, 10,000 - 15,000 g 离心 15 分钟。取上清液（即含酶样品），置于冰上备用。尽快测定或分装冻存于 -80°C。
    • 体液样品 (如血清、血浆)： 新鲜采集，离心去除细胞碎片。可直接用于测定（体积根据活性调整）或稀释后使用。避免反复冻融。

  2. 蛋白浓度测定：

    • 采用 Bradford 法、Lowry 法或 BCA 法测定样品上清液中的总蛋白浓度。测定结果用于将酶活性标准化为比活力（单位/mg蛋白）。
    • 记录蛋白浓度。

  3. 酶促反应体系建立 (总体积 1 mL，可在比色皿中直接混合)：

    • 预热分光光度计至 25°C 或 37°C（根据实验设计选择）。
    • 在干净的比色皿中依次加入：
      • 反应缓冲液： 约 700 - 800 µL (体积需调整以确保最终总体积为 1 mL)。
      • 样品上清液（含 TPX）： 10 - 100 µL (根据预实验结果调整，确保 ΔA/min 在适宜线性范围内)。
      • 还原型硫氧还蛋白 (Trx-(SH)₂)： 加入终浓度 ≥ 1 µM (如 10 µL 的 100 µM 储备液)。
      • 硫氧还蛋白还原酶 (TrxR)： 加入终浓度 ≥ 50 mU/mL (如 20 µL 的 5 U/mL 储备液)。
      • 还原型谷胱甘肽 (GSH)： 加入终浓度 1 mM (如 100 µL 的 10 mM 储备液)。 (辅助维持还原环境)。
      • 超纯水： 适量 (补足至 980 - 990 µL)。
    • 轻轻混匀，放入恒温比色槽中平衡 3-5 分钟。
    • 加入启动底物 (开始反应)：
      • 加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)： 加入终浓度 200 µM (如 20 µL 的 10 mM 储备液)。立即混匀。
      • 记录反应启动时间 (t=0)。立即监测 340 nm 处吸光度随时间的变化 (A₃₄₀ vs t) 约 1-2 分钟，以建立稳定的基线斜率（此斜率主要反映 TrxR 本身的背景活性或 NADPH 的自发氧化速率）。该斜率应很小且稳定。
    • 加入测定底物（启动TPX反应）：
      • 加入过氧化物底物（H₂O₂ 或 t-BOOH）： 加入终浓度达到所需工作浓度（如 100 µL 的 1 mM H₂O₂ 储备液，使终浓度为 100 µM）。立即彻底混匀。
      • 立即开始连续监测 340 nm 处吸光度随时间的变化 (A₃₄₀ vs t)，持续 3-5 分钟 或直到反应速率明显下降（通常记录最初线性下降部分，持续 30-90秒）。确保反应速率（ΔA/min）是线性的。

  4. 对照设置 (至关重要)：

    • 样品空白对照： 在最终的酶促反应体系中，不加过氧化物底物，用等体积的超纯水代替。用于校正样品中可能存在的 NADPH 氧化酶或其他消耗 NADPH 的背景活性。
    • 试剂空白对照 (系统空白)： 在最终的酶促反应体系中，不加样品上清液，用等体积的匀浆/裂解缓冲液代替。用于校正反应体系中所有试剂（主要是 TrxR）自身消耗 NADPH 的背景活性。
    • 非酶促反应对照： 在最终的酶促反应体系中，不加 TrxR，用等体积反应缓冲液代替。理论上 NADPH 消耗应极低。用于验证反应对 TrxR 的依赖性。
    • 阳性对照： 使用已知活性的纯化 TPX 标准品（如果有的话），按相同步骤操作。

五、结果计算

  1. 计算反应速率 (ΔA/min)：

    • 从反应曲线（A₃₄₀ vs t）上，选取过氧化物加入后吸光度线性下降的初始阶段（通常是最初 30-90 秒）。
    • 用线性回归法计算该线性段的斜率 (k)，单位为 ΔA/min（吸光度变化值每分钟）。
    • 扣除背景： 将样品反应管的 ΔA/min (k_sample) 减去 样品空白对照 的 ΔA/min (k_sample_blank) 和 试剂空白对照 的 ΔA/min (k_reagent_blank)，得到 校正后的反应速率（ΔA/min）corrected：

      ΔA/min_corrected = k_sample - k_sample_blank - k_reagent_blank

  2. 计算酶活性：

    • 基于 NADPH 消耗：
      • NADPH 在 340 nm 的摩尔消光系数 (ε) 为 6.22 mM⁻¹ cm⁻¹ (在 pH 7-8 范围内基本恒定)。
      • 反应体积 (V) 为 1 mL (0.001 L)。
      • 样品体积 (v_sample) 为加入的样品体积 (L)。
      • 酶活性 (U/mL) = (ΔA/min_corrected * V) / (ε * l * v_sample)
        • ΔA/min_corrected: 校正后的吸光度变化速率 (min⁻¹)
        • V: 反应体系总体积 (L) = 0.001 L
        • ε: NADPH 在 340 nm 的摩尔消光系数 = 6.22 L mmol⁻¹ cm⁻¹
        • l: 比色皿光径 (cm) = 1 cm
        • v_sample: 加入的样品体积 (L)
      • 单位定义 (U)： 在上述特定反应条件下（温度、pH、底物浓度），每分钟催化消耗 1 μmol NADPH 所需的酶量定义为 1 个酶活性单位 (Unit, U)。
    • 计算比活力：
      • 将测得的酶活性 (U/mL样品) 除以样品中的蛋白质浓度 (mg protein/mL 样品)。

      比活力 (U/mg protein) = [酶活性 (U/mL样品)] / [蛋白浓度 (mg protein/mL 样品)]

六、注意事项

  1. 样品处理： 操作全程在冰上进行（除反应阶段外），避免酶失活。样品裂解后尽快测定，如需冻存应分装于 -80℃ 冰箱，避免反复冻融。冻融后离心去除沉淀。
  2. 试剂稳定性： NADPH、Trx-(SH)₂、TrxR 溶液需新鲜配制或使用近期解冻的分装液。NADPH 溶液对光敏感，需避光操作和保存。H₂O₂ 浓度不稳定，临用前需精确标定（可在 240 nm 用ε=43.6 M⁻¹ cm⁻¹ 测定）。
  3. 反应条件优化：
    • 样品量： 调整加入的样品量，使 ΔA/min 在加入底物后初始阶段的下降速率在 0.01 - 0.05 /min 范围内为佳（确保在线性范围内且信号足够强）。
    • 底物浓度： 选择合适的底物（H₂O₂ 或 t-BOOH）及其浓度（通常在 Km 值附近）。常用 H₂O₂ 100-500 µM，t-BOOH 500 µM - 1 mM。需进行初速度实验确定底物饱和浓度。
    • 温度： 严格控制反应温度（25°C 或 37°C），温度波动会影响酶活性和反应速率。
  4. 背景扣除： 严格设置并扣除样品空白对照和试剂空白对照至关重要，特别是当样品本身背景较高或 TrxR 活性较强时。
  5. 线性范围： 确保监测的反应速率处于线性期（ΔA/min 恒定）。如果速率过快（ΔA/min > 0.1/min）或过慢（< 0.005/min），需稀释样品或增加样品量。
  6. 特异性： 虽然 TPX 是主要催化者，但反应体系依赖于完整的 Trx/TrxR 系统。结果反映的是样品中能利用硫氧还蛋白系统还原过氧化物的 TPX 总活性。某些样品可能含有其他干扰酶（如谷胱甘肽过氧化物酶 GPx，若用 H₂O₂ 作底物时），但 GPx 通常不利用 Trx 系统，故干扰较小。如需更特异性测定某类 TPX (Peroxiredoxin)，可考虑使用特异性抗体或抑制剂。
  7. 数据记录： 详细记录实验条件（温度、波长、样品体积、所有试剂终浓度、仪器型号、操作者、日期等）和计算结果公式。
  8. 重现性： 建议每个样品做至少 2-3 个技术重复（同一份样品重复测定），以评估操作误差。

七、方法学要点总结

本 NADPH 偶联动力学测定法通过连续监测 NADPH 在 340 nm 处吸光度的下降速率，间接反映 TPX 的催化活性。方法的关键在于：

  • 提供完整的硫氧还蛋白系统（Trx-(SH)₂ 和 TrxR）。
  • 使用 NADPH 作为最终的还原当量供体。
  • 精确控制反应条件（温度、pH）。
  • 严格设置和扣除合适的空白对照。
  • 确保反应在初速度阶段（线性期）进行测量。
  • 将酶活性标准化为单位蛋白的比活力。

本方案提供了一个标准化的、可比的测定 TPX 活性的框架，适用于大多数生物样品。研究者可根据具体实验目的和样品特性，在遵循核心原理的基础上对某些细节（如缓冲液 pH、底物种类浓度、样品量）进行优化验证。