谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）测定

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性测定方法详解

一、 引言

谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GPX, EC 1.11.1.9）是生物体内重要的抗氧化酶之一，广泛存在于需氧生物的各种组织中。其主要功能是利用还原型谷胱甘肽（GSH）作为氢供体，催化还原过氧化氢（H₂O₂）及有机氢过氧化物（ROOH）生成水和相应的醇，从而保护细胞膜结构和功能蛋白免受氧化损伤。GPX活性是评估机体氧化应激状态和抗氧化能力的关键指标，在生物医学研究、营养学、毒理学及疾病诊断等领域具有广泛应用价值。

二、 测定原理（NADPH 偶联法）

目前应用最广泛的是基于谷胱甘肽还原酶（GR）和还原型辅酶II（NADPH）的偶联动力学测定法（间接法）。其核心反应过程如下：

  1. GPX 催化反应：
ROOH (或 H₂O₂) + 2GSH → ROH (或 H₂O) + GSSG + H₂OGPX 催化过氧化物（ROOH 或 H₂O₂）与 2 分子还原型谷胱甘肽（GSH）反应，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水或醇。

2. GR 偶联反应：

GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺生成的 GSSG 在谷胱甘肽还原酶（GR）的催化下，利用 NADPH 提供的氢原子和质子（H⁺）重新还原为 2 分子 GSH，同时 NADPH 被氧化为 NADP⁺。

3. 吸光度监测： 由于 NADPH 在 340 nm 波长处具有特征性吸收峰，而 NADP⁺ 在此波长无吸收。因此，反应体系中 NADPH 的消耗速率（表现为 340 nm 吸光度的下降速率 ΔA/min）与 GPX 催化还原过氧化物的速率成正比，进而可以反映出 GPX 的活性。

三、 试剂与材料

  • 反应缓冲液： 通常为磷酸盐缓冲液（如 50 mM, pH 7.0），内含 EDTA（如 1 mM）以螯合金属离子。
  • 还原型谷胱甘肽（GSH）溶液： 临用前配制，浓度根据方法优化（如 2-10 mM）。
  • 谷胱甘肽还原酶（GR）溶液： 适量活性单位（如 0.5-2 U/mL 反应体系）。
  • 还原型辅酶 II（NADPH）溶液： 临用前配制（如 0.15-0.3 mM 反应终浓度）。
  • 过氧化物底物溶液：
    • 常用底物： 叔丁基过氧化氢（t-BuOOH）或枯烯过氧化氢（Cumene Hydroperoxide）。使用前用缓冲液稀释至合适浓度（如 0.5-5 mM 反应终浓度）。
    • H₂O₂： 也可作为底物，但需注意其易分解且对某些 GPX 同工酶（如 GPX1）特异性更高。浓度需精确控制（如 0.1-0.5 mM 反应终浓度）。
  • 样本处理液： 用于组织匀浆或细胞裂解（如含 Triton X-100 的缓冲液）。组织样本通常需高速离心（如 10,000-15,000 g, 4℃, 10-15min）取上清液作为待测样品。
  • 蛋白浓度测定试剂： 如考马斯亮蓝法（Bradford 法）或 BCA 法试剂。
  • 仪器设备：
    • 紫外/可见分光光度计或酶标仪（配备 340 nm 滤光片/波长）。
    • 恒温水浴槽或具有温控功能的酶标仪（通常设定为 25℃ 或 37℃）。
    • 精密移液器。
    • 计时器。
    • 离心机。
    • 匀浆器或超声破碎仪（用于样本制备）。

四、 实验步骤

以下为标准操作流程示例（96孔板酶标法或比色杯法通用思路）：

  1. 预热： 将所有试剂（除 NADPH 和样本外）平衡至测定温度（如 25℃ 或 37℃）。
  2. 配制反应混合液： 按比例混合足量的下述成分（体积以最终反应体积计算）：
    • 反应缓冲液
    • GSH 溶液（达到所需终浓度）
    • GR 溶液（达到所需活性单位）
    • 过氧化物底物溶液（达到所需终浓度）。注意：NADPH 和待测样本此时不加入。
  3. 加样：
    • 在比色杯或酶标板孔中加入适量反应混合液。
    • 加入适量待测样本（组织匀浆上清液、血清、细胞裂解液等）或空白对照（用样本稀释液代替）。
    • 加入 NADPH 溶液（达到所需终浓度）。注意：NADPH 应在最后一步加入以启动反应。
  4. 混匀与启动反应： 迅速轻柔混匀（避免产生气泡），立即放入已预热的仪器中。
  5. 动力学监测： 在 340 nm 波长下，连续监测吸光度（A₃₄₀）变化 1-5 分钟（或根据 ΔA/min 稳定线性区间确定），记录时间间隔（如每 15-30 秒）的吸光度值。测定温度保持恒定。
  6. 样本蛋白浓度测定： 使用考马斯亮蓝法或 BCA 法测定待测样本的蛋白质浓度（mg/mL）。

五、 结果计算

  1. 计算吸光度变化率 (ΔA/min)：

    • 根据记录的吸光度值（A₃₄₀）对时间（min）作图。
    • 选择线性下降最稳定的区间段（通常是反应开始后的 30-90 秒），计算每分钟吸光度的下降值（ΔA/min）。计算公式为： ΔA/min = (A_start - A_end) / (t_end - t_start) 其中 A_start 和 A_end 分别为选定区间起始和终止时间的吸光度，t_start 和 t_end 为对应的时间点（min）。
    • *样本管 ΔA/min： 待测样本反应体系的 ΔA/min。
    • *样本空白管 ΔA/min (可选但推荐)： 反应体系中不含过氧化物底物（用缓冲液代替），用于扣除样本中可能存在的非特异性 NADPH 消耗。如果显著，计算时应减去此值。
    • *试剂空白管 ΔA/min (可选)： 反应体系中不含待测样本（用样本稀释液代替），用于监控试剂背景。通常极小，可忽略，或用于验证系统稳定性。

  2. 计算酶活性：

    • 摩尔消光系数法： NADPH 在 340 nm 的摩尔消光系数 ε₃₄₀ 为 6.22 × 10³ L·mol⁻¹·cm⁻¹。
    • 酶活性单位定义 (U)： 一个酶活性单位通常定义为在特定测定条件下（温度、pH），每分钟催化消耗 1 μmol NADPH 所需的酶量。
    • 计算公式： GPX 活性 (U/mL) = [ (ΔA/min_sample - ΔA/min_blank) × V_total × df ] / (ε × L × V_sample)
      • ΔA/min_sample：样本管的吸光度下降速率 (min⁻¹)。
      • ΔA/min_blank：样本空白管（不含底物）的吸光度下降速率 (min⁻¹)。
      • V_total：反应体系总体积 (mL)。
      • df：样本测定前的稀释倍数。
      • ε：NADPH 在 340 nm 的摩尔消光系数 (6.22 × 10³ L⁻¹·mol⁻¹·cm⁻¹)。
      • L：比色杯光径 (cm)。对于标准 1 cm 光径比色杯，L=1；对于酶标仪，需参照仪器手册确认有效光径（通常小于 1 cm）。
      • V_sample：反应体系中加入的样本体积 (mL)。
    • 比活性 (常用形式)： 为了消除样本蛋白含量差异的影响，常报告比活性 (Specific Activity)： GPX 比活性 (U/mg prot) = GPX 活性 (U/mL) / 样本蛋白浓度 (mg prot/mL)

六、 注意事项

  1. 样本制备：
    • 组织样本应迅速取材，液氮速冻或直接匀浆，低温操作，避免反复冻融。
    • 细胞样本裂解要充分但避免过度导致酶失活。
    • 血清/血浆样本避免溶血。高速离心去除颗粒物。
    • 样本应在冰上保存，尽快测定。如需保存，-80℃ 分装冻存。
  2. 试剂稳定性：
    • NADPH、GSH 溶液需临用前新鲜配制，避光低温保存（冰浴）。NADPH 水溶液不稳定。
    • GR 活性需保证，避免反复冻融。
    • 过氧化物底物（尤其 H₂O₂）浓度需准确，防止自发分解。
  3. 反应条件优化与验证：
    • 反应体系中各组分浓度（GSH, GR, NADPH, 底物）需根据具体样本类型（组织、细胞、血清）和预期活性范围进行预实验优化，确保反应速率在线性范围内（ΔA/min 在 0.02-0.2 之间较理想）。
    • 底物类型选择：t-BuOOH/CumOOH 适用于总 GPX 活性（含 Se-GPX 和非 Se-GPX），H₂O₂ 主要反映 Se-GPX（如 GPX1）活性。明确所用底物的适用范围。
    • pH 值：严格控制在最适 pH（通常 pH 7.0 附近），pH 偏差显著影响酶活。
    • 温度：保持恒定，温度波动影响反应速率。明确报告测定温度（25℃ 或 37℃）。
    • 线性范围：确保在选定的监测时间内，ΔA/min 保持良好线性，且样本活性在此范围内。否则需稀释样本。
  4. 干扰因素：
    • 样本中高含量的血红蛋白、胆红素、脂质可能干扰 340 nm 吸光度测定。严重溶血、黄疸或脂血样本需谨慎处理或特殊前处理。
    • 样本中可能存在其他消耗 NADPH 的酶（如谷胱甘肽硫转移酶 GST），样本空白管有助于扣除部分干扰。
    • 确保 GR 活性足够且稳定，避免其成为限速步骤。
  5. 质量控制：
    • 每次实验设置空白对照（样本空白、试剂空白）。
    • 使用已知活性的标准品或质控样本进行平行测定，监控批内和批间精密度与准确性。
  6. 结果报告： 清晰注明：
    • 所用底物种类（H₂O₂, t-BuOOH, CumOOH）。
    • 测定温度（25℃ 或 37℃）。
    • 酶活性单位定义（通常为 U）。
    • 结果表示形式（总活性 U/mL 或比活性 U/mg prot）。
    • 样本类型和处理方法简述。

七、 应用与意义

通过准确测定 GPX 活性，研究者可以：

  • 评估生物体（动物、植物、微生物）或特定组织/细胞的抗氧化能力。
  • 研究氧化应激在疾病（如心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、癌症）发生发展中的作用。
  • 评价药物、营养素（如硒、维生素 E、多酚类物质）、环境污染物等的抗氧化/促氧化效应。
  • 作为生物标志物辅助疾病的诊断、预后判断及疗效监测。

八、 总结

NADPH 偶联法是测定谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性可靠、灵敏且应用广泛的动力学方法。其成功实施依赖于对原理的深刻理解、试剂的精确配制与保存、反应条件的严格优化控制以及对潜在干扰因素的识别和处理。规范化的实验操作和严谨的数据分析是获取可靠、可比性强的 GPX 活性数据的关键，从而为深入研究氧化还原生物学及相关领域提供重要的实验依据。