氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量测定

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：3 作者：生物检测中心

氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 含量测定标准流程

一、 引言

谷胱甘肽 (Glutathione, GSH) 是生物体内含量最丰富的非蛋白巯基化合物，以还原型 (GSH) 和氧化型 (GSSG) 两种形式存在。GSH/GSSG 比值是评估细胞氧化应激状态的关键指标。GSSG 含量的精确测定，对于研究生物体氧化还原平衡、抗氧化防御能力、以及多种疾病（如神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等）的病理生理机制至关重要。本方法基于成熟的酶循环法，具有特异性高、灵敏度好、操作相对简便的特点。

二、 测定原理

本方法的核心是利用谷胱甘肽还原酶 (Glutathione Reductase, GR) 的专一性催化作用，以及 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB) 的显色反应：

  1. 消除还原型谷胱甘肽 (GSH) 干扰： 在样品处理阶段，加入 2-乙烯吡啶 (2-Vinylpyridine, 2-VP) 或 N-乙基马来酰亚胺 (N-Ethylmaleimide, NEM)。这些试剂能特异性地与样品中的 GSH 分子上的巯基 (-SH) 发生烷基化反应，形成稳定的加合物，从而阻断 GSH 参与后续的酶促反应和显色反应，确保测定结果仅反映 GSSG 的含量。

    • (以 NEM 为例反应式： GSH + NEM → GS-NEM)

  2. 酶促还原 GSSG： 在测定体系中加入过量的还原型辅酶 II (NADPH) 和谷胱甘肽还原酶 (GR)。GR 催化 GSSG 还原为 2 分子的 GSH，同时消耗 NADPH 转化为 NADP⁺。

    • 反应式： GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺

  3. DTNB 显色反应： 新生成的 GSH 立即与 DTNB 反应，生成黄色的 5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子 (TNB²⁻)。

    • 反应式： GSH + DTNB → GSSG + TNB²⁻ (黄色) + H⁺
    • TNB²⁻ 在 412 nm 波长处具有特征性强吸收峰。

  4. 定量关系： 在整个循环反应中， 一分子的 GSSG 最终导致一分子的 NADPH 被消耗，并产生两分子的 TNB²⁻。通过监测反应速率（单位时间内 412 nm 吸光度的增加速率 ΔA₄₁₂/min），该速率与体系中 GSSG 的浓度成正比。通过已知浓度的 GSSG 标准品绘制标准曲线，即可计算出样品中 GSSG 的含量。

三、 实验材料与试剂

  • 样品： 组织匀浆液、细胞裂解液、血浆、血清、植物提取液等 (需明确样品类型及预处理方法，如匀浆缓冲液成分、离心条件等)。
  • 主要试剂：
    • 氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 标准品：用于配制标准曲线。
    • 还原型辅酶 II (NADPH)：三钠盐形式。
    • 谷胱甘肽还原酶 (GR)：来源于酵母菌或动物组织。
    • 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)。
    • 2-乙烯吡啶 (2-VP) 或 N-乙基马来酰亚胺 (NEM)：用于掩蔽 GSH。
    • 磷酸盐缓冲液 (PBS)：例如 0.1 M， pH 7.5 (含 1-5 mM EDTA，用于螯合金属离子)。
    • NADPH 稀释液：例如可用 0.1% (w/v) NaHCO₃ 溶液溶解 NADPH (临用前配制或分装冻存)。
    • GR 稀释液：例如可用冷的 0.1 M PBS (pH 7.5) 稀释 (临用前稀释)。
    • DTNB 溶液：例如 6 mM (用 0.1 M PBS, pH 7.5 溶解，棕色瓶避光保存)。
    • 中和试剂 (若使用 2-VP)：三乙醇胺溶液 (例如 1 M)。
    • 注意： 所有试剂应使用高纯度去离子水配制。具体浓度需根据实验体系优化。

四、 实验步骤

(一) 样品预处理 (关键步骤：消除 GSH)

  1. 样品准备： 收集新鲜样品，按常规方法制备组织匀浆、细胞裂解液等 (离心去除沉淀，取上清液)。血液样品需抗凝 (如 EDTA)，离心分离血浆/血清。样品制备后应尽快处理或冻存于 -80°C。
  2. GSH 掩蔽：
    • 方案 A (使用 NEM)：
      • 取适量样品 (含 GSH/GSSG)，加入适量 NEM 溶液 (终浓度通常为 5-20 mM)。
      • 涡旋混匀，室温 (约 25°C) 避光孵育 30-60 分钟，确保 GSH 烷基化完全。
      • (可选步骤：部分方案在孵育后加入少量还原型谷胱甘肽消耗过量 NEM)
    • 方案 B (使用 2-VP)：
      • 取适量样品 (含 GSH/GSSG)，加入适量 2-VP (终浓度通常为 1-2% v/v)。
      • 涡旋混匀，室温避光孵育 60 分钟。
      • 加入适量三乙醇胺溶液 (终浓度通常为 1 M)，涡旋混匀，室温放置 10 分钟，中和过量的 2-VP。
  3. 稀释： 将掩蔽 GSH 后的样品用预冷的 0.1 M PBS (含 EDTA, pH 7.5) 进行适当稀释 (稀释倍数需根据样品中 GSSG 预估浓度确定，使最终测定浓度在标准曲线范围内)。稀释后的样品即为“GSH 掩蔽样品液”，用于 GSSG 测定。

(二) 标准曲线制备

  1. 用 0.1 M PBS (含 EDTA, pH 7.5) 溶解 GSSG 标准品，配制一系列浓度梯度 (如 0, 2, 5, 10, 20, 50 µM) 的标准溶液。
  2. 注意： 标准溶液 不需要 进行 GSH 掩蔽步骤，因其不含干扰的 GSH。

(三) 测定程序 (以 96 孔板或比色皿分光光度法为例)

  • 建议体系 (示例，需优化)：
    • 总体积：200 µL
    • 测定波长：412 nm
    • 温度：30°C 或 37°C (保持恒定)
    • 模式：动力学模式 (Kinetic mode)，监测 ΔA₄₁₂/min
  1. 配制底物混合液 (临用前配制)：
    • 按比例混合：
      • DTNB 溶液 (例如终浓度 0.2-0.6 mM)
      • NADPH 溶液 (例如终浓度 0.2-0.3 mM)
      • 谷胱甘肽还原酶 (GR) 溶液 (例如终活性 0.5-2 U/mL)
    • 计算好总量，确保足够用于所有空白、标准和样品孔/管。冰浴保存。
  2. 加样：
    • 空白管/孔： 加入 40 µL PBS + 160 µL 底物混合液。
    • 标准管/孔： 加入 40 µL GSSG 标准溶液 + 160 µL 底物混合液。
    • 样品管/孔： 加入 40 µL GSH 掩蔽样品液 + 160 µL 底物混合液。
  3. 混合与启动反应： 加样后立即充分混匀 (涡旋或微量振荡器)。
  4. 吸光度监测： 迅速将反应体系置于预热的分光光度计或酶标仪中，在 412 nm 波长下，于选定的恒温条件下 (如 30°C)，监测吸光度变化 3-5 分钟 (或直至获得稳定的线性区间)。
  5. 记录数据： 记录吸光度随时间变化的曲线，计算各管/孔的 吸光度变化速率 (ΔA₄₁₂/min)。通常取反应开始后约 30 秒至 2 分钟内的线性部分计算斜率。

五、 结果计算

  1. 计算反应速率： 对每个标准品和样品，计算其 ΔA₄₁₂/min。

  2. 扣除空白： 样品和标准品的 ΔA₄₁₂/min 均需减去空白孔的 ΔA₄₁₂/min，得到 ΔA₄₁₂/min (校正)。

  3. 绘制标准曲线： 以 GSSG 标准品浓度 (μM) 为横坐标 (X)，对应的 ΔA₄₁₂/min (校正) 为纵坐标 (Y)，绘制标准曲线 (通常为过原点的直线)。得到线性回归方程：Y = k * X，其中 k 为斜率。

  4. 计算样品 GSSG 浓度：

    • 根据样品的 ΔA₄₁₂/min (校正) 值 (Y_sample)，利用标准曲线方程反推，得到反应体系中 GSSG 的浓度 (X_sample)，单位为 μM： X_sample = Y_sample / k
    • 考虑样品在测定前的稀释倍数 (Dilution Factor, DF)：在掩蔽 GSH 后通常有一次稀释 (步骤一.3)。
    • 考虑样品在原始生物材料中的稀释情况：例如，1 g 组织加 9 mL 缓冲液匀浆，则组织稀释倍数为 10 (mL/g 或 w/v)。细胞样品需根据细胞计数计算 (如 µM/10⁶ cells)。

    最终样品中 GSSG 含量计算通用公式：

GSSG 含量 = X_sample (μM) * DF * (原始样品制备稀释倍数) / (原始样品量)* **单位转换示例：** * **组织 (nmol/g tissue)：** `= X_sample (μM) * DF * (匀浆体积 mL / 组织重量 g) * 1000` * *解释：X_sample (μM) = µmol/L; DF 无量纲； (匀浆体积 mL / 组织重量 g) 即 mL/g (常为 10 mL/g)；乘以 1000 将 µmol 转换为 nmol。* * **细胞 (nmol/10⁶ cells)：** `= X_sample (μM) * DF * (裂解体积 mL / 细胞数 * 10⁶) * 1000` * *解释：(裂解体积 mL / 细胞数 * 10⁶) 即 mL per million cells。* * **液体样本 (血浆/血清, μM)：** `= X_sample (μM) * DF` *(原始样品即血浆/血清本身，其“制备稀释倍数”可视为 1，原始样品量即加入掩蔽反应的体积需考虑)* **重要：** 公式中的 `原始样品制备稀释倍数` 和 `原始样品量` 需根据具体的样品前处理方法精确代入。

六、 注意事项

  1. GSH 掩蔽是关键： NEM 或 2-VP 的处理时间和浓度必须优化并确保充足，以完全烷基化 GSH。不完全掩蔽会导致 GSSG 测定值显著偏高。使用 2-VP 时，中和步骤也很重要。
  2. 速度与温度： NADPH 在溶液中不稳定，尤其是在中性和碱性条件下。底物混合液应临用前配制并置于冰上。整个加样和启动反应过程要迅速。反应温度需保持恒定。
  3. 酶活性： GR 的活性直接影响反应速率。确保 GR 溶液新鲜或正确保存（通常 -20°C 冻存），使用前在冰上溶解，避免反复冻融。根据试剂说明或预实验确定合适的酶用量。
  4. 线性范围： 确保样品和标准品的最终测定浓度在标准曲线的线性范围内。吸光度变化速率 ΔA₄₁₂/min 应在仪器检测的线性响应区间内。
  5. 样品稳定性： 生物样品中的 GSH/GSSG 易氧化或降解。样品收集后应尽快处理 (冰浴操作)，或立即加入酸（如偏磷酸、磺基水杨酸）使蛋白质变性并稳定巯基，然后冻存于 -80°C。测定前再中和并掩蔽 GSH (需验证酸处理对掩蔽效率的影响)。加入 EDTA 有助于抑制金属离子催化的氧化反应。
  6. 背景干扰： 样品基质可能含有其他能与 DTNB 反应的物质（如蛋白质巯基，但掩蔽步骤通常处理了游离巯基）或内源性 GR/NADPH。空白对照的设置至关重要。高蛋白样品可能需要除蛋白（沉淀法中常用酸）。
  7. 仪器校准： 分光光度计或酶标仪需提前预热并校准波长和光程。
  8. 安全操作： DTNB、NEM、2-VP 等试剂有一定毒性或刺激性，应在通风橱中配制和使用，佩戴手套、护目镜等防护装备。按规范处理废液。

七、 方法特点

  • 优点： 特异性高（依赖于 GR 的专一性和 GSH 掩蔽）、灵敏度较好（可检测低至 µM 甚至 nM 级别）、原理清晰、操作相对标准化。
  • 缺点/局限：
    • 步骤相对繁琐，尤其 GSH 掩蔽步骤需要严格控制。
    • 依赖 NADPH 的稳定性。
    • 需要专门的酶（GR）和底物（NADPH）。
    • 样品基质复杂时可能存在干扰。

八、 参考文献 (核心方法学依据)

  1. Tietze, F. (1969). Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Analytical Biochemistry, 27(3), 502–522. (经典 DTNB 法基础)
  2. Griffith, O. W. (1980). Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Analytical Biochemistry, 106(1), 207–212. (引入 2-VP 掩蔽 GSH 的标准方法)
  3. Rahman, I., Kode, A., & Biswas, S. K. (2006). Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nature Protocols, 1(6), 3159–3165. (详细的现代酶循环法操作流程)
  4. 后续大量的应用文献均基于上述原理进行优化和应用。

本操作规程提供了一个基于酶循环法的 GSSG 测定框架。在实际应用中，需根据具体的研究对象（组织、细胞、体液类型）、样品基质背景、仪器条件等因素对试剂浓度、样品稀释倍数、反应体积、孵育时间等进行充分的优化和验证，并通过设置合理的对照（如处理空白、加标回收实验）确保结果的准确性和可靠性。