还原型谷胱甘肽（GSH）测定

还原型谷胱甘肽（GSH）测定：原理、方法及临床意义

还原型谷胱甘肽（Glutathione Reduced Form, GSH）是细胞内含量最丰富的非蛋白巯基化合物和三肽（γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸）。作为关键的抗氧化剂、解毒剂和氧化还原状态调节者，GSH水平是评估机体氧化应激程度、解毒能力和某些疾病状态的重要生物标志物。准确测定还原型谷胱甘肽（GSH）及其与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值，对于疾病诊断、机制研究和治疗监测具有重要意义。

一、 还原型谷胱甘肽（GSH）的生理功能

1. 抗氧化防御核心：
   • GSH能直接清除自由基（如·OH, RO·）。
   • 作为谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的底物，催化过氧化氢（H₂O₂）和脂质过氧化物的还原，自身被氧化为GSSG。
   • 保护蛋白质、脂质、核酸免受氧化损伤。
2. 解毒作用：
   • 在谷胱甘肽-S-转移酶（GST）催化下，GSH亲核基团（-SH）与亲电子性毒素（如药物代谢中间体、环境污染物、致癌物）结合，形成水溶性更强的复合物，促进其排出体外。
3. 维持细胞氧化还原平衡：
   • GSH/GSSG比值是细胞氧化还原状态的关键指标。高GSH/GSSG比值代表还原环境，对细胞功能（如信号传导、基因表达、增殖分化）至关重要。
   • 谷胱甘肽还原酶（GR）利用NADPH将GSSG还原回GSH，维持高GSH/GSSG比值。
4. 参与氨基酸转运（γ-谷氨酰基循环）：
   • 细胞膜上的γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）利用GSH启动氨基酸转运过程。
5. 调节免疫功能： 影响淋巴细胞增殖、分化及功能。
6. 其他功能： 参与蛋白质合成、DNA合成与修复、铁代谢等过程。

二、 GSH测定的重要性

• 氧化应激评估： GSH水平下降和/或GSSG水平升高（GSH/GSSG比值降低）是氧化应激的可靠标志，与衰老及多种疾病（神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病并发症、慢性炎症、癌症等）发生发展密切相关。
• 肝脏功能评估： 肝脏是GSH合成和储存的主要器官。肝损伤（酒精性肝病、病毒性肝炎、药物性肝损伤、非酒精性脂肪性肝病等）常导致肝细胞内或血浆GSH水平下降。GSH消耗是某些药物（如对乙酰氨基酚）肝毒性的关键机制。
• 营养状况评估： GSH合成依赖氨基酸前体（谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸）和含硒辅因子（GPx需要）。营养不良或特定氨基酸缺乏可影响GSH水平。
• 某些遗传代谢病诊断： 如谷胱甘肽合成酶缺乏症、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶缺乏症等。
• 治疗监测： 评估抗氧化治疗（如N-乙酰半胱氨酸NAC补充）的效果。
• 衰老研究： 年龄增长常伴随GSH水平下降。

三、 主要GSH测定方法

由于GSH易被氧化，且在样品处理过程中容易发生转化，准确测定GSH需要快速、特异的方法和严格的样本处理流程。常用方法包括：

1. 基于Ellman试剂的比色法（DTNB法）：

   • 原理： 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB），即Ellman试剂，与游离巯基（-SH）反应生成2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB⁻），在412 nm处有强吸收峰（黄色）。反应特异性针对游离巯基。
   • 优点： 操作相对简便、快速、成本低。
   • 缺点：
     • 缺乏特异性： 测定的是所有游离巯基（包括蛋白质巯基和其他小分子巯基物质），非GSH专属。通常需先用酸沉淀去除蛋白质。
     • 易受干扰： GSSG和其他氧化型化合物不反应。若需测总谷胱甘肽（GSH + GSSG），需先用还原剂（如DTE, TCEP）将GSSG还原为GSH再测定。单独测GSSG则需先用衍生化试剂（如N-乙基马来酰亚胺，NEM）封闭GSH的巯基，再还原测定GSSG。
     • 灵敏度相对较低： 适用于浓度较高的样本（如细胞裂解液、组织匀浆）。
   • 适用范围： 实验室初步筛查、细胞和组织样本的总巯基或总谷胱甘肽测定（结合还原步骤），需注意校正和干扰排除。

2. 酶循环法（酶法）：

   • 原理：
     • 利用谷胱甘肽还原酶（GR）特异催化NADPH还原GSSG生成GSH的逆反应。
     • GR仅作用于GSSG。在反应体系中加入过量GSSG和GR，GSH会竞争性抑制GR催化NADPH还原GSSG的反应速率。
     • 测定NADPH在340 nm处吸光度下降的速率（ΔA/min），其抑制程度与样品中GSH浓度成反比（需标准曲线）。
   • 优点：
     • 特异性高： 主要针对GSH（因为GR仅识别GSSG/GSH对）。
     • 灵敏度较高： 优于DTNB法。
     • 可直接测定GSH（初步抑制法）： 无需预先衍生或分离。
   • 缺点：
     • 反应速率测定需要精密仪器（如分光光度计）。
     • 反应条件（温度、pH）需严格控制。
     • 试剂成本相对较高。
   • 适用范围： 临床应用（如生化分析仪）、科研中要求较高特异性和灵敏度的样本（血清/血浆、细胞培养液）。

3. 高效液相色谱法（HPLC）：

   • 原理： 高效分离技术。样品经预处理（如去蛋白、衍生化）后，注入色谱柱，利用待测物在固定相和流动相中分配系数的差异进行分离，再通过检测器进行定量。
   • 衍生化：
     • 电化学检测（ECD）： 常用柱前衍生试剂（如碘乙酸、NEM）封闭巯基，提高稳定性和检测灵敏度（尤其是ECD）。
     • 紫外/可见光（UV/VIS）或荧光检测（FLD）： 常用衍生试剂如邻苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯等，使其产生强吸收或荧光信号。
   • 优点：
     • 高特异性： 可同时分离并准确定量GSH、GSSG以及其他巯基化合物（如半胱氨酸）。
     • 高灵敏度： 尤其使用荧光或电化学检测器时。
     • 可直接测定GSH/GSSG比值： 是金标准方法之一。
   • 缺点：
     • 操作复杂、耗时长、成本高。
     • 需要专业技能和昂贵的仪器设备。
     • 样品前处理（尤其是衍生化）步骤繁琐，易引入误差。
   • 适用范围： 科研中对准确度和灵敏度要求极高的场合，特别是需要同时测定GSH和GSSG或研究其他巯基代谢物时。

4. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）：

   • 原理： HPLC进行分离，质谱进行高选择性、高灵敏度的检测。通常使用同位素内标进行绝对定量。
   • 优点：
     • 最高特异性和灵敏度： 能排除绝大多数干扰。
     • 无需衍生化： 简化前处理步骤（尽管有时仍需要）。
     • 可同时定量多种相关代谢物： 如同型半胱氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸等。
     • 结果最准确可靠。
   • 缺点：
     • 仪器极其昂贵，运行维护成本高。
     • 操作极其复杂，需要高度专业的技术人员。
   • 适用范围： 高端实验室研究、临床参考方法、新生物标志物开发验证。

四、 样本采集与处理（关键环节）

GSH极不稳定，样本处理不当是结果误差的主要来源。

1. 样本类型：

   • 全血： 需立即处理（如加入含NEM的溶液稳定GSH并防止氧化，然后快速冷冻）。
   • 血浆/血清： 采集后需立即分离（离心），并加入蛋白沉淀剂（如偏磷酸、三氯醋酸）或巯基保护剂/封闭剂（如NEM）。首选血浆（肝素抗凝），凝血过程可能导致GSH氧化或消耗。
   • 红细胞： 富含高浓度GSH。需洗涤红细胞，裂解后快速处理（加稳定剂或沉淀蛋白）。
   • 组织： 快速取出后，立即液氮速冻或投入含稳定剂的溶液中匀浆。
   • 细胞： 培养细胞需快速洗涤裂解，加入稳定剂或立即分析。
   • 尿液： 需酸化保存。

2. 防止氧化：

   • 操作全程尽可能在冰上或低温环境进行。
   • 使用含有金属螯合剂（如EDTA, DTPA）和巯基保护/封闭剂（如NEM）的缓冲液。
   • 避免剧烈震荡和反复冻融（样本处理好后应分装冻存于-70℃或以下）。

3. 去蛋白： 常用酸沉淀法（如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等），需快速进行并中和上清液（尤其对酶法或比色法）。

五、 结果解读与影响因素

1. 参考区间： 参考值范围因检测方法、样本类型（全血、血浆、红细胞）、人群（年龄、性别、地域）、实验室而异。使用时应依据检测实验室提供的参考范围。例如：
   • 健康成人全血GSH： 大致范围可能在700 - 1200 µmol/L。
   • 健康成人血浆/血清GSH： 浓度远低于全血，通常在1 - 15 µmol/L范围。（这些数值仅作示意，不可直接用于临床判断）。
2. GSH/GSSG比值： 被认为是比单一GSH浓度更灵敏的氧化应激指标。健康状态下细胞内比值通常很高（>100:1甚至>300:1），氧化应激时显著下降。
3. 影响因素：
   • 生理因素： 年龄（新生儿较高，随年龄增长下降）、性别（某些研究显示男性可能略高）、昼夜节律、运动、饮食（富含蔬果饮食可能升高）。
   • 病理状态： 见“重要性”部分所述疾病。
   • 药物： 对乙酰氨基酚（过量）、化疗药物、抗生素（某些）、扑热息痛等消耗剂；NAC、α-硫辛酸等补充剂可能升高。
   • 样本质量： 溶血（红细胞GSH极高）、处理延迟、保存不当导致结果偏低（氧化损失）或偏高（未完全去蛋白）。
   • 检测方法： 不同方法间结果可能存在差异。

六、 质量控制

• 标准品： 使用高纯度、准确称量的GSH标准品绘制标准曲线。
• 内控品： 在每批检测中运行已知浓度的质控样品（高、中、低值）。
• 精密度评价： 通过批内、批间重复性评估方法的稳定性。
• 回收率实验： 评估样品基质对测定的影响。
• 室间质评： 参加权威机构组织的室间质量评价计划。
• 规范操作： 严格执行标准操作规程（SOP）。

七、 总结与展望

还原型谷胱甘肽（GSH）是评估机体抗氧化防御状态和氧化还原平衡的核心生物标志物。其准确测定在基础研究、临床诊断（尤其是肝脏疾病、氧化应激相关疾病）和药物监测中具有重要价值。选择合适的检测方法（需权衡特异性、灵敏度、通量和成本）、严格遵守标准化和规范化的样本采集与处理流程、进行严格的质量控制，是获得可靠GSH检测结果的关键。随着分析技术的发展，特别是LC-MS/MS的普及，GSH及其相关代谢物（包括氧化型GSSG、半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸等）的精准、多重检测将更深入地揭示其在健康和疾病中的作用机制，为精准医疗提供更丰富的信息。未来研究的重点也包括开发更快速、简便、适用于床旁检测（POCT）的可靠方法，以及进一步明确不同生理病理条件下各种生物样本中GSH水平的标准化参考范围和临床解读路径。