琥珀酸脱氢酶（SDH）测定

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

琥珀酸脱氢酶（SDH）测定：原理、方法与注意事项

一、引言

琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase， SDH）是三羧酸循环（TCA循环或Krebs循环）中的关键酶，催化琥珀酸氧化脱氢生成延胡索酸（富马酸）。此反应同时将电子传递给酶结合的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），进而通过铁硫簇传递给电子受体（如泛醌）。SDH位于线粒体内膜，是连接TCA循环与线粒体呼吸链电子传递链（复合物II）的重要桥梁。其活性直接反映了细胞有氧呼吸的状态、线粒体功能完整性以及组织细胞的代谢活力。因此，SDH活性的测定在生物化学研究、组织病理学评估（如某些肿瘤中SDH亚基的突变）、心肌与骨骼肌功能研究、氧化应激及药物靶点筛选等领域具有重要意义。

二、测定原理

SDH测定的核心原理是基于酶促反应过程中伴随的电子转移，通过监测电子受体的还原状态变化来间接反映酶活性。最常用的方法是分光光度法，常使用人工电子受体2,6-二氯靛酚（2,6-Dichlorophenolindophenol， DCIP）。

  1. 酶促反应：

    • SDH催化底物琥珀酸脱氢： 琥珀酸 + 受体（氧化态） → 延胡索酸 + 受体（还原态） + 2H⁺
    • 在DCIP作为人工电子受体的测定体系中： 琥珀酸 + DCIP（氧化态，蓝色） → 延胡索酸 + DCIP（还原态，无色） + 2H⁺

  2. 检测原理：

    • 氧化态的DCIP在600nm波长附近有特征性最大吸收峰，呈现蓝色。
    • 当DCIP被SDH催化反应还原后，其蓝色消失（变为无色），导致在600nm处的吸光度（A₆₀₀）下降。
    • SDH的活性与单位时间内A₆₀₀的下降速率（ΔA₆₀₀/min）成正比。通过监测A₆₀₀随时间的变化，即可计算出酶的催化活性。

三、所需试剂与材料

  1. 试剂：
    • 缓冲液： 常用0.1 M pH 7.4-7.6的磷酸缓冲液（K₂HPO₄/NaH₂PO₄或K₂HPO₄/KH₂PO₄）或0.05 M pH 7.5的Tris-HCl缓冲液（注意：Tris可能轻微抑制SDH，磷酸盐通常是首选）。
    • 底物溶液： 0.2 M琥珀酸钠溶液（溶于上述缓冲液）。需用NaOH调节pH至7.4-7.6。
    • 电子受体： 0.002 M 2,6-二氯靛酚（DCIP）溶液（溶于蒸馏水或缓冲液，避光保存）。
    • 抑制剂（选择性添加）： 0.2 M丙二酸钠溶液（用于设置空白对照）。丙二酸是SDH的竞争性抑制剂。
    • 线粒体制备相关试剂（若测组织匀浆）： 匀浆介质（如0.25 M蔗糖， 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4），必要时需差速离心制备线粒体组分。
    • 蛋白浓度测定试剂： 如考马斯亮蓝法（Bradford法）或双缩脲法所需试剂。
  2. 材料：
    • 分光光度计（带恒温比色槽）
    • 石英或玻璃比色皿（光程通常1cm）
    • 恒温水浴锅
    • 精密移液器及吸头
    • 计时器
    • 组织匀浆器/超声破碎仪（测组织样本）
    • 离心机（测组织样本）
    • 冰盒
    • pH计
    • 实验记录本

四、实验步骤（以组织匀浆上清或线粒体样品为例）

  1. 样品制备：

    • 新鲜组织（如肝脏、心肌、骨骼肌）于冰预冷的匀浆介质中快速称重。
    • 按重量/体积比（如1:9或1:10）加入匀浆介质，在冰浴中用匀浆器充分匀浆。
    • 匀浆液在4°C下低速离心（如600-1000 g, 10分钟），去除细胞碎片、核等。
    • 收集上清液（此为粗线粒体/胞浆组分），可直接用于测定（通常包含SDH）。如需更纯净的线粒体，将此上清液在4°C下高速离心（如10,000-15,000 g, 10-15分钟），沉淀即为线粒体；沉淀用匀浆介质重悬。
    • 立即测定或分装后液氮速冻，-80°C保存（活性可能略有损失）。

  2. 反应体系建立（示例体积，可按比例缩放）：

    • 总反应体积： 通常为1-3 ml。
    • 反应混合液（在比色皿中预先混合）：
      • 缓冲液（磷酸缓冲液）： 适量体积（确保最终体系浓度0.05-0.1 M, pH 7.4-7.6）。
      • 琥珀酸钠溶液： 0.1 ml (最终浓度≈20 mM)。
      • DCIP溶液： 0.1 ml (最终浓度≈0.2 mM)。
      • 蒸馏水： 适量体积（使达到最终体积减去样品体积）。
    • 将比色皿放入恒温比色槽中（通常设定为25°C或37°C，需根据文献或实验目的确定），预热数分钟使温度平衡。
    • 空白对照体系： 在另一比色皿中，用等体积的丙二酸钠溶液取代反应混合液中的琥珀酸钠溶液，其他成分相同。或者，在体系中预先加入足量丙二酸抑制剂（终浓度>10 mM）。

  3. 测定启动与数据记录：

    • 记录恒温槽设定温度（如37°C）。
    • 向预热好的反应混合液比色皿中加入适量体积的样品（组织匀浆上清或线粒体悬液，通常含10-100 μg蛋白）。迅速轻柔混匀。
    • 立即将比色皿放入分光光度计比色槽。
    • 在600nm波长下，启动计时器并开始连续记录吸光度（A₆₀₀）变化。通常在加入样品后的30秒至数分钟内，每分钟读数一次（或使用仪器的动力学模式自动记录），持续记录至少5-10分钟（或直到线性良好的下降曲线出现足够长的一段）。
    • 空白对照测定： 同样操作，将样品加入含有丙二酸的空白对照体系中，记录A₆₀₀变化（应基本无下降或下降极慢）。

五、数据处理与计算

  1. 绘制反应曲线： 以时间（min）为横坐标，A₆₀₀为纵坐标，绘制样品管和空白管的反应曲线。
  2. 计算反应速率： 选择曲线中线性下降最佳的一段（通常是最初的2-5分钟），计算每分钟吸光度的变化值（ΔA₆₀₀/min）。
    • 样品反应速率（V_sample）= |斜率_sample| (取绝对值，单位：ΔA/min)
    • 空白反应速率（V_blank）= |斜率_blank| (取绝对值，单位：ΔA/min)
  3. 计算净反应速率： V_net (ΔA/min) = V_sample - V_blank 此V_net代表由SDH催化的特异性反应速率。
  4. 计算SDH活性： SDH活性通常表示为单位时间内，单位重量蛋白还原DCIP的量（或消耗底物的量）。常用单位有：
    • μmol DCIP reduced/min/mg protein：
SDH活性 = (V_net * V_t * 1000) / (ε * d * V_s * P)* V_net： 净反应速率 (ΔA/min) * V_t： 反应体系总体积 (ml) * 1000： 将mol转换为μmol (μmol = 10⁻⁶ mol) * ε： DCIP在测定波长（600nm）和缓冲液中的摩尔消光系数 **(单位：L·mol⁻¹·cm⁻¹)**。**必须实际测定或查阅可靠的文献值**。在pH 7.5磷酸缓冲液中，ε₆₀₀ ≈ **21,000 L·mol⁻¹·cm⁻¹** 是一个常用参考值（但强烈建议自行验证或引用明确来源）。 * d： 比色皿光程 (cm， 通常为1 cm) * V_s： 加入到反应体系中样品体积 (ml) * P： 样品中蛋白质浓度 (mg protein/ml) - **需单独用考马斯亮蓝法或双缩脲法测定样品蛋白浓度。** * **国际单位（U）/mg protein：** 1 U定义为在特定条件下（温度、pH）每分钟催化1 μmol底物（琥珀酸）转化所需的酶量。由于SDH催化反应中转化的琥珀酸摩尔数与还原的DCIP摩尔数相等（1:1），因此按上述公式计算出的“μmol DCIP reduced/min/mg protein” 在数值上等同于 “μmol succinate oxidized/min/mg protein”，即 “U/mg protein”。 * **其他常用单位：** mU/mg protein (1 mU = 0.001 U), U/g wet weight tissue (需知道组织重量和匀浆体积)。

六、注意事项

  1. 样品新鲜度与处理： SDH位于线粒体内膜上，其活性对样品处理敏感。组织应尽快取出、冰上操作，避免反复冻融。匀浆过程保持低温。
  2. 温度控制： 酶促反应速率对温度敏感，比色槽必须精确恒温。报告中需注明测定温度（25°C或37°C最常见）。
  3. pH值： 缓冲液的pH需精确配制和校准，SDH在pH 7.4-7.6活性最佳。
  4. DCIP稳定性： DCIP溶液不稳定，尤其对光敏感，需新鲜配制或避光保存于棕色瓶（4°C），使用前检查其A₆₀₀是否在预期范围。
  5. 摩尔消光系数（ε）： 这是计算活性的关键常数。务必使用在相同缓冲液、相同pH、相同温度、相同波长下测定或文献报道的准确ε值。不同条件下ε值差异很大。
  6. 反应线性： 确保在计算速率的时段内，A₆₀₀下降呈良好的线性关系。反应时间过长可能因底物消耗、产物抑制或酶失活而偏离线性。样品量应调整使ΔA₆₀₀/min在0.02-0.1范围内较理想。
  7. 空白对照： 设立丙二酸抑制的空白对照至关重要，它能扣除样品中非SDH引起的DCIP还原（如其它还原性物质）。
  8. 底物浓度： 琥珀酸钠浓度（通常15-25mM）应达到饱和水平（接近Vmax），以保证测得的是最大反应速度。必要时可做米氏常数（Km）测定。
  9. 内源性底物/抑制剂： 组织样品中可能存在内源性琥珀酸或丙二酸。高速离心制备线粒体并用介质洗涤有助于减少干扰。
  10. 样品蛋白浓度： 准确的蛋白浓度测定是标准化酶活性的基础。
  11. 安全： 实验操作遵循常规实验室安全规范。

七、总结

分光光度法通过监测DCIP在600nm处吸光度的下降来测定琥珀酸脱氢酶（SDH）活性，是一种相对简便、可靠且广泛应用的方法。该方法的核心在于将SDH催化的电子转移过程转化为可光学检测的信号变化。要获得准确可靠的结果，关键在于严格控制实验条件（温度、pH）、使用准确的摩尔消光系数、设立合适的空白对照、确保反应在线性期内进行分析，并对样品蛋白浓度进行精确测定。严格按照规程操作并注意上述事项，SDH活性测定可为研究线粒体功能、细胞能量代谢及相关病理生理过程提供重要的生化指标。