α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）测定

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性测定：原理与方法详解

α-酮戊二酸脱氢酶（α-Ketoglutarate Dehydrogenase, α-KGDH）是三羧酸循环（TCA循环）中的关键限速酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。该酶活性变化与细胞能量代谢、氧化应激、神经退行性疾病等多种生理病理过程密切相关。准确测定其活性对于代谢研究至关重要。本文将详细介绍α-KGDH活性的测定原理（主要聚焦分光光度法）和实验步骤。

一、 α-KGDH的酶学功能

α-KGDH是一个多酶复合体（类似丙酮酸脱氢酶复合体），包含三种酶：

  1. α-酮戊二酸脱氢酶（E1）： 催化α-酮戊二酸脱羧，并与硫胺素焦磷酸（TPP）形成中间产物。
  2. 二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶（E2）： 将E1上的羟乙基-TPP转移到其自身的硫辛酰基上，形成琥珀酰二氢硫辛酰胺，并将琥珀酰基转移给辅酶A（CoA-SH）生成琥珀酰辅酶A。
  3. 二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3）： 利用黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）将E2上的还原态二氢硫辛酰胺重新氧化为氧化态硫辛酰胺，同时将电子传递给烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），生成NADH + H+。

总反应式： α-酮戊二酸 + NAD+ + CoA-SH → 琥珀酰辅酶A + NADH + H+ + CO2

二、 测定原理：分光光度法（最常用）

核心原理是监测反应产物NADH的生成速率。NADH在波长340 nm处有特征吸收峰，而反应底物NAD+在此波长无吸收。因此，通过连续监测反应体系在340 nm处吸光度（Abs₃₄₀）随时间的变化，其上升速率（ΔAbs₃₄₀ / min）即可反映NADH的生成速率，从而计算出α-KGDH的酶活性。

关键反应组分及其作用：

  • α-酮戊二酸： 酶促反应的主要底物。
  • 辅酶A（CoA-SH）： 必需底物，提供巯基形成琥珀酰辅酶A。
  • 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）： 最终电子受体，其还原形式NADH是检测目标。
  • 辅助因子： 硫胺素焦磷酸（TPP）、Mg²⁺（或Mn²⁺）通常是酶发挥最佳活性所必需的。
  • 硫辛酸： 有时添加以补充复合体中可能损失的组分。
  • 缓冲液： 维持反应体系最适pH（通常在7.0-8.0之间，如Tris-HCl或磷酸钾缓冲液）。

三、 实验材料与试剂

  • 样本： 组织匀浆液（新鲜制备，低温操作）、细胞裂解物、线粒体提取物或纯化的酶制剂。样本需置于冰上保持低温。
  • 主要试剂：
    • 缓冲液（如100-200 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0，含EDTA）
    • NAD+溶液（如终浓度2-5 mM）
    • 辅酶A溶液（如终浓度0.1-0.3 mM）
    • 硫胺素焦磷酸（TPP）溶液（如终浓度0.2-0.5 mM）
    • 氯化镁（MgCl₂）溶液（如终浓度2-5 mM）
    • α-酮戊二酸溶液（如终浓度2-10 mM）
    • 硫辛酸溶液（可选，如终浓度0.05-0.1 mM）
  • 设备：
    • 紫外/可见分光光度计（具恒温比色槽或温控功能）
    • 微量移液器及枪头
    • 石英或紫外兼容比色皿
    • 计时器
    • 恒温水浴锅或温控模块（温度通常设定为25℃，30℃或37℃）
    • 离心机（用于样本制备）
    • 冰盒

四、 实验步骤（分光光度法示例）

  1. 样本制备（预冷环境进行）：

    • 组织：称取适量组织，加入冰冷的匀浆缓冲液（通常含0.25 M蔗糖、缓冲液、蛋白酶抑制剂），冰浴匀浆。低温离心（如1000×g, 10分钟）去除细胞碎片，上清液即为粗酶液（胞浆+线粒体混合组分）。如需测定线粒体α-KGDH，需进一步分离纯化线粒体。
    • 细胞：收集细胞，冰冷PBS洗涤，加入裂解缓冲液（含缓冲液、去垢剂如Triton X-100、蛋白酶抑制剂），冰上裂解。离心（如12000×g, 10-15分钟）去除细胞碎片，取上清。
    • 样本蛋白浓度测定：使用Bradford法等测定样本蛋白浓度，用于后续计算比活性。

  2. 试剂配制： 按最终反应体系体积计算所需体积，用相应缓冲液新鲜配制各试剂母液。NAD+、CoA-SH等不稳定试剂宜临用前配制或分装冻存后避免反复冻融。

  3. 反应体系建立（示例体积1 ml）：

    • 空白管： 在比色皿中加入：
      • 适量缓冲液（保证总体积）
      • NAD+溶液（终浓度）
      • CoA-SH溶液（终浓度）
      • TPP/MgCl₂溶液（终浓度）
      • 硫辛酸溶液（如需）
      • 用于校正非酶促反应或样本内源性消耗。
    • 样本管： 在另一比色皿中加入：
      • 适量缓冲液（保证总体积）
      • NAD+溶液（终浓度）
      • CoA-SH溶液（终浓度）
      • TPP/MgCl₂溶液（终浓度）
      • 硫辛酸溶液（如需）
      • 适量酶样本（如50-100 μL组织/细胞提取物）。 样本体积需优化，确保吸光度变化在仪器线性范围内（通常ΔA₃₄₀/min在0.02-0.1为宜）。

  4. 预温育： 将装有反应混合液（不含底物α-酮戊二酸！）的空白管和样本管置于预设温度（如30℃或37℃）的分光光度计比色槽中平衡3-5分钟，使温度均一。

  5. 启动反应与监测：

    • 向空白管和样本管中分别快速加入预温的α-酮戊二酸溶液（启动反应的底物）。迅速轻柔混匀（避免产生气泡），立即放入分光光度计。
    • 设置分光光度计参数：波长340 nm，温度恒定，连续监测模式。
    • 立即开始计时，连续记录吸光度（Abs₃₄₀）随时间的变化至少3-5分钟（或直至获得稳定的线性变化段）。

  6. 终止反应： 通常不需特殊终止，监测到足够线性段即可停止记录。

五、 数据处理与结果计算

  1. 斜率计算：

    • 选取反应曲线中吸光度随时间线性上升最平稳的阶段（通常启动反应后30秒至2分钟之间）。
    • 计算该线性阶段的斜率（ΔAbs₃₄₀ / min）。这是反应速率（v）的体现。

  2. 酶活性计算：

    • 体积活性（U/ml）： 单位体积样本每分钟催化生成1 μmol NADH所需的酶量定义为一个活性单位（U）。 体积活性 (U/ml) = (ΔAbs₃₄₀ / min) × (V_t × 1000) / (ε × d × V_s)
    • 比活性（U/mg prot）： 单位质量蛋白所含酶的活性单位。这是最常用的表达方式，便于不同样本间比较。 比活性 (U/mg prot) = [ (ΔAbs₃₄₀ / min) × (V_t × 1000) ] / (ε × d × V_s × C_p)
    • 式中：
      • ΔAbs₃₄₀ / min：每分钟吸光度变化值（样本管斜率 - 空白管斜率，扣除背景）。
      • V_t：反应体系总体积（ml，如1 ml）。
      • 1000：体积换算系数（1 ml = 1000 μL）。
      • ε：NADH在340 nm处的摩尔消光系数（L mol⁻¹ cm⁻¹）。理论值为6220 L mol⁻¹ cm⁻¹。实践中，建议使用实际测定值或确认仪器精度（如用已知浓度NADH标准品测定）。
      • d：比色皿光径（cm，通常为1 cm）。
      • V_s：反应体系中加入的样本体积（ml）。
      • C_p：样本的蛋白浓度（mg/ml）。

六、 注意事项

  1. 酶的稳定性： α-KGDH复合体，特别是其E3组分，对氧化应激敏感且相对不稳定。样本制备需全程低温（冰浴），尽快测定。避免反复冻融粗酶液。
  2. 试剂稳定性： NAD+、CoA-SH、TPP等辅因子易氧化或降解，务必使用新鲜配制或妥善保存的溶液。α-酮戊二酸溶液也应在临用前配制或避免长期储存。
  3. 干扰因素：
    • 内源性底物/辅因子： 样本中可能含有内源性的α-酮戊二酸、NAD(P)H、丙酮酸等，会干扰基线或反应速率。设置样本空白对照非常重要（反应体系中不加α-酮戊二酸，其他同样本管）。
    • 其它脱氢酶： 样本中存在的其他NAD(P)+依赖的脱氢酶（如乳酸脱氢酶LDH）可能消耗或生成NAD(P)H，干扰测定。优化反应条件并做好空白对照有助于减小影响。有时可添加抑制剂（如氨甲蝶呤抑制某些依赖四氢叶酸的酶）。
    • 底物抑制： 过高浓度的α-酮戊二酸（>15 mM）可能抑制酶活性，需优化浓度。
  4. 温度控制： 酶活性对温度敏感。务必确保分光光度计比色槽温度精确恒定，反应混合液在加入底物前已达到设定温度。
  5. 混匀操作： 加入起始底物后，迅速彻底混匀是获得准确初始速率的关键。避免剧烈震荡产生气泡（影响光路）。
  6. 线性范围： 确保反应初速率在线性期内测定（吸光度变化与时间呈良好线性关系）。若ΔA₃₄₀/min过大（>0.1），则需稀释样本。
  7. pH优化： 不同来源的α-KGDH最适pH可能略有差异（常在pH 7.4-8.2）。建议进行预实验确定所用体系的最佳pH。

七、 其他测定方法（简要提及）

  • 放射性同位素法： 使用¹⁴C标记的α-酮戊二酸，通过测定释放的¹⁴CO₂放射性强度来计算酶活。灵敏度高，但操作复杂且有放射性危害，应用较少。
  • 酶偶联法： 利用其他酶（如苹果酸脱氢酶MDH）来偶联检测α-KGDH产生的琥珀酰辅酶A或间接检测NADH。可进一步提高灵敏度或特异性，但体系更复杂。
  • 荧光法： 基于NADH的荧光特性（激发~340 nm，发射~460 nm）进行检测。灵敏度高于分光光度法，但易受样本背景荧光干扰。

总结：

分光光度法测定α-酮戊二酸脱氢酶活性是基于其催化反应中NADH生成的原理。该方法相对简便、快速、设备普及率高，是研究细胞能量代谢和相关疾病中α-KGDH功能的常用手段。成功的关键在于：样本的新鲜制备与低温操作、高质量试剂的正确配制、精确的温度和时间控制、严格的空白对照扣除以及反应速率在线性范围内的准确测量。通过标准化操作流程并充分考虑注意事项，研究者可以获得可靠且可重复的α-KGDH活性数据。