NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）测定

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）活性测定实验方案

一、引言

NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-Malatedehydrogenase，NADP-MDH， EC 1.1.1.82）是一种重要的氧化还原酶，广泛存在于植物、某些细菌和藻类中。在植物中，NADP-MDH 主要定位于叶绿体和细胞质：

  1. 叶绿体: 在C4光合途径（如玉米、甘蔗）和景天酸代谢（CAM）植物中，叶绿体NADP-MDH 催化草酰乙酸（OAA）还原为苹果酸（Malate），同时消耗NADPH。此反应对CO2的初始固定和浓缩机制至关重要，产生的苹果酸是向维管束鞘细胞运输CO2的主要载体之一。
  2. 细胞质: 细胞质NADP-MDH（通常受氧化还原调节）参与维持细胞内的还原力（NADPH/NADP⁺）平衡和氧化还原稳态，尤其在非光合组织或逆境响应中发挥作用。

因此，准确测定NADP-MDH活性对研究植物光合效率、碳代谢调控、抗逆生理（如干旱、盐胁迫响应）以及相关基因功能验证等具有重要意义。本方案提供了一种基于紫外分光光度法的NADP-MDH活性体外测定方法。

二、测定原理

本方法依据NADP-MDH催化的还原反应（生理方向）进行活性测定：

草酰乙酸 (OAA) + NADPH + H⁺ ⇌ 苹果酸 (Malate) + NADP⁺

在反应体系中加入过量的底物草酰乙酸（OAA）和还原辅酶II（NADPH），酶促反应开始后，NADPH被氧化生成NADP⁺。NADPH在340 nm波长处具有特征吸收峰，而NADP⁺在该波长下无吸收。因此，反应液中NADPH浓度的下降速率（即340 nm处吸光度下降的速率，ΔA₃₄₀/min）与NADP-MDH的活性成正比。通过连续监测反应体系在340 nm处吸光度的下降值，即可计算出酶的催化活性。

三、实验材料与仪器

  • 植物材料: 新鲜采集的植物组织（如叶片），迅速用液氮冷冻，-80℃保存备用。
  • 主要试剂:
    • 提取缓冲液（预冷至4℃）: 通常包含50-100 mM Tris-HCl 或 HEPES-KOH (pH 7.5-8.0)， 1-5 mM EDTA（整合金属离子）， 1-5 mM DTT（二硫苏糖醇，保持酶还原状态）， 0.1%-0.5% (w/v) PVP（聚乙烯吡咯烷酮，吸附多酚）， 0.05%-0.2% (v/v) Triton X-100（非离子型去垢剂，增溶膜蛋白）。具体组分和浓度可根据样本类型优化。
    • 反应缓冲液（现配或预冷）: 通常包含50-100 mM Tris-HCl 或 HEPES-KOH (pH 7.8-8.3)， 1-10 mM MgCl₂（某些同工酶需要）。
    • NADPH溶液: 用重蒸水或反应缓冲液配制适量浓度的母液（如10 mM），小份分装避光-20℃保存，临用前稀释至工作浓度（如0.2 mM）。
    • 草酰乙酸（OAA）溶液: 用重蒸水或反应缓冲液配制适量浓度的母液（如50-100 mM），小份分装避光-20℃保存（OAA不稳定，建议现配现用或临用前解冻）。工作浓度通常为0.5-5.0 mM。
    • 重蒸水或超纯水。
  • 主要仪器设备:
    • 预冷研钵和研杵（或组织研磨仪）
    • 冷冻高速离心机
    • 紫外-可见分光光度计（带恒温比色皿架）
    • 石英比色皿（光程1 cm）
    • 精密移液器及配套吸头
    • 冰盒
    • 计时器

四、实验步骤

  1. 酶粗提液制备（全程冰上操作）:

    1. 称取适量（如0.2-0.5 g）冷冻植物组织，置于预冷研钵中，加入液氮快速研磨成细粉。
    2. 待液氮挥发完，加入适量预冷的提取缓冲液（体积通常为组织鲜重的3-5倍，如1 g样本加3-5 mL），继续冰浴研磨至充分匀浆。
    3. 将匀浆液转移至预冷的离心管中。
    4. 4℃， 12000-15000 ×g 离心15-20分钟。
    5. 小心吸取上清液，置于冰上备用或暂时保存于4℃（应尽快测定）。此上清液即为酶粗提液（Crude Enzyme Extract, CEE）。记录提取体积和所用组织重量。

  2. 反应体系建立与活性测定（在分光光度计恒温条件下进行，如25℃或30℃）:

    1. 开启分光光度计，设定波长340 nm，预热并调节恒温比色槽至所需温度（如25℃）。
    2. 在石英比色皿中加入下列组分（反应总体积通常为1 mL）:
      • 反应缓冲液： 适量（如980 μL）
      • NADPH工作液： 适量（如10 μL，终浓度0.2 mM）
      • 酶粗提液（CEE）： 适量（如10-50 μL，具体体积需预试验确定，使ΔA₃₄₀/min在0.02-0.1之间较理想）。用重蒸水补足至总体积减去OAA体积（如补至995 μL）。
    3. 将比色皿放入恒温比色槽中，加盖（防止蒸发），孵育3-5分钟使温度平衡。
    4. 加入预温至反应温度的草酰乙酸（OAA）工作液（如5 μL，终浓度0.5或1.0 mM），立即轻柔颠倒混匀（避免产生气泡），按下计时器开始计时。
    5. 立即将比色皿放入光路，启动仪器记录功能，连续监测340 nm处吸光度（A₃₄₀）的变化3-5分钟（或直至出现稳定的线性下降段）。

  3. 空白对照设置: 同时设置空白对照，通常有两种方式：

    • 方式一（试剂空白）：不加酶液，用等体积提取缓冲液代替酶粗提液。用于扣除试剂背景。
    • 方式二（酶失活空白）：将酶粗提液煮沸5分钟后冷却，或用等体积提取缓冲液代替OAA溶液。用于扣除酶液中可能存在的其他干扰反应。 空白对照的操作步骤与样品测定完全相同。

五、结果计算

  1. 确定反应速率: 选择反应开始后吸光度稳定线性下降的时间段（通常避开最初的快速混合期和后期底物消耗期），读取该时间段内每分钟吸光度的变化值 (ΔA₃₄₀/min)。仪器软件通常可直接计算斜率（即反应速率 v = ΔA₃₄₀/min）。

  2. 计算酶活性: 酶活性通常以单位重量植物组织（鲜重Fresh Weight, FW 或 干重Dry Weight, DW）每分钟催化转化1 μmol NADPH所需的酶量定义为一个酶活力单位 (Unit, U)。计算公式如下：

    酶活性 (U/g FW) = [ (ΔA₃₄₀/min_sample - ΔA₃₄₀/min_blank) × V_total × DF ] / (ε × d × V_enzyme × FW)

    酶活性 (U/mg protein) = [ (ΔA₃₄₀/min_sample - ΔA₃₄₀/min_blank) × V_total × DF ] / (ε × d × V_enzyme × Protein_conc)

    • ΔA₃₄₀/min_sample: 样品反应的平均每分钟吸光度变化值 (ΔA/min)。
    • ΔA₃₄₀/min_blank: 空白对照的平均每分钟吸光度变化值 (ΔA/min)。
    • V_total: 反应体系总体积 (mL)。
    • DF: 酶粗提液在测定前可能的稀释倍数 (未稀释则为1)。
    • ε: NADPH 在340 nm处的摩尔消光系数 (6.22 L mmol⁻¹ cm⁻¹ 或 6220 M⁻¹ cm⁻¹)。注意确保反应体系pH接近7.8-8.0。
    • d: 比色皿光程 (cm)，通常为1 cm。
    • V_enzyme: 加入反应体系的酶粗提液体积 (mL)。
    • FW: 用于制备酶粗提液的植物组织鲜重 (g)。
    • Protein_conc: 酶粗提液中的蛋白质浓度 (mg/mL)，通常需要用 Bradford 法或 Lowry 法测定。当使用单位蛋白活性时，需要此值。

六、关键注意事项

  1. 低温操作: 酶对温度敏感，样品研磨、离心、提取液保存和反应前的操作务必在冰上进行。
  2. 及时性: 酶粗提液制备后应尽快测定活性，放置过久（尤其在较高温度下）会导致酶失活。
  3. 底物稳定性: OAA在水溶液中不稳定（易脱羧生成丙酮酸），必须现配现用或分装冷冻保存，避免反复冻融。NADPH溶液对光敏感，需避光保存和使用。
  4. 反应线性期: 确保测定的吸光度下降处于线性阶段（ΔA₃₄₀/min恒定），这是计算结果准确的前提。初始底物浓度应过量。
  5. 酶量优化: 加入酶液的体积需通过预实验优化，使ΔA₃₄₀/min落在仪器检测灵敏度和线性范围内（通常在0.02-0.08/min）。
  6. 干扰排除: 植物样品（尤其叶片）常含多酚、色素等干扰物质。PVP有助于吸附多酚。如粗提液颜色过深，可适当稀释或考虑用其他方法澄清（如PVPP过滤）。
  7. pH准确性: NADPH的摩尔消光系数ε随pH变化（在pH 7.5-8.0时约为6.22），务必确保反应缓冲液的pH准确且在测定温度下校正。
  8. 温度控制: 反应温度需严格恒定，温度波动会影响酶活性和ε值。
  9. 对照设置: 务必设置合适的空白对照以扣除背景吸收和非特异性反应。
  10. 仪器校准: 使用前确保分光光度计波长和光密度读数准确。

七、应用与意义

本测定方案广泛用于：

  • 光合生理研究：评估C4植物、CAM植物叶片光合碳同化途径中的关键酶活性及其效率。
  • 基因功能研究：通过比较转基因/突变体与野生型植株的NADP-MDH活性，验证基因在碳代谢中的作用。
  • 植物抗逆生理：研究干旱、盐碱、高温等胁迫条件下植物体内NADP-MDH活性的变化规律，揭示其在氧化还原平衡和能量供应中的响应机制。
  • 作物育种辅助指标：筛选具有高光合效率或强抗逆性的作物种质资源。
  • 微生物代谢研究：分析某些依赖苹果酸代谢的细菌或藻类的代谢通路。

通过精确测定NADP-MDH活性，研究人员能够深入理解生物体碳固定、能量代谢及逆境适应的分子机制，为农业增产、抗逆品种选育及生物技术应用提供重要理论依据。

重要提示：

  • 实验参数（如缓冲液pH、离子强度、底物浓度、反应温度）可根据研究对象（植物种类、组织部位）和特定实验目的进行优化。
  • 对于组织特异性或亚细胞定位研究，可能需要更精细的样品分离步骤（如组织解剖、细胞器分离）。