NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）测定

发布时间：2025-06-24 08:51:39 阅读量：2 作者：生物检测中心
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NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性测定方法

一、测定原理

NAD-苹果酸脱氢酶催化以下可逆反应：

草酰乙酸 + NADH + H⁺ ⇌ L-苹果酸 + NAD⁺

本测定方法基于分光光度法，通过监测反应体系中还原型辅酶I（NADH） 在 340 nm 波长处吸光度（A₃₄₀）的下降速率来定量酶活性。NADH在该波长具有特征性光吸收，而氧化型辅酶I（NAD⁺）则基本不吸收。反应向右进行（苹果酸生成）时，NADH被消耗，导致A₃₄₀下降。下降速率与酶活性成正比。

二、所需试剂与溶液

  • Tris-HCl缓冲液（0.1 M, pH 7.5 - 8.0）： 称取适量Tris碱溶于蒸馏水中，用HCl溶液调节至所需pH（通常7.5-8.0范围较佳），定容。4°C储存。
  • 还原型辅酶I（NADH）溶液（约12 mM）： 称取适量NADH二钠盐，用预冷的Tris-HCl缓冲液溶解。临用前配制，避光保存于冰上（NADH水溶液不稳定）。
  • 草酰乙酸（OAA）溶液（约15 mM）： 称取适量草酰乙酸单钠盐，用预冷的Tris-HCl缓冲液溶解。临用前配制，避光保存于冰上（草酰乙酸在水溶液中不稳定，易脱羧生成丙酮酸）。
  • 终止液（可选）： 通常使用强酸（如6 M HCl）或强碱（如2 M NaOH）快速终止反应。仅当需要固定某个时间点的反应状态时使用。
  • 待测样品： 含有NAD-MDH的溶液（如组织匀浆上清液、细胞裂解液、部分纯化的酶液等）。样品需适当稀释，确保测定时A₃₄₀下降速率在仪器线性范围内（通常ΔA₃₄₀/min在0.01-0.1为宜）。
  • 蒸馏水或去离子水。

三、所需仪器设备

  • 紫外-可见分光光度计（带恒温比色槽）
  • 石英比色皿（光径1 cm）
  • 可调移液器及配套吸头
  • 秒表
  • 恒温水浴锅（或分光光度计内置温控）
  • 冰盒
  • 离心机（用于样品前处理）
  • pH计
  • 容量瓶、烧杯等常用玻璃器皿

四、操作步骤（以测定正向反应活性为例）

  1. 系统预热与平衡： 开启分光光度计，设定波长为340 nm。将恒温比色槽温度调至测定所需温度（常用25°C或30°C，需在报告中注明），并预热至少15分钟。所有试剂（缓冲液、NADH溶液、OAA溶液）和待测样品置于冰上备用。
  2. 工作混合液配制（以测定1个样品为例）： 在预冷的微量离心管或小烧杯中，按以下体积配制工作混合液（总体积需覆盖空白和样本测定所需，可按比例放大）：
    • Tris-HCl缓冲液（0.1 M, pH）：X μL（确保最终反应体积正确）
    • NADH溶液（12 mM）：Y μL（确保反应体系中NADH终浓度约为0.15-0.2 mM）
    • 蒸馏水：Z μL
    • 总体积： 例如 980 μL （预留加入样品和底物的空间）
    • 计算示例： 设最终反应体积为1.0 mL (1000 μL)，NADH终浓度0.2 mM，OAA终浓度0.5 mM。则需：
      • NADH (12 mM) 体积 = (0.2 mM * 1000 μL) / 12 mM ≈ 16.7 μL
      • OAA (15 mM) 体积 = (0.5 mM * 1000 μL) / 15 mM ≈ 33.3 μL
      • 缓冲液 + 水体积 = 1000 μL - 16.7 μL (NADH) - 33.3 μL (OAA) - 样品体积 (如20 μL) ≈ 930 μL
    • 注意： 具体体积需根据确定的终浓度和样品加入量精确计算。工作混合液通常包含除底物（OAA）外的所有成分。
  3. 空白管设置（调零）：
    • 取1个石英比色皿，加入：
      • 工作混合液：980 μL (按上述示例)
      • 蒸馏水：20 μL (模拟样品体积)
    • 轻轻混匀，放入已恒温的比色槽中，孵育2-3分钟使温度平衡。
    • 读取初始吸光度A₀（通常在340nm下应为0.8-1.2，表明NADH浓度足够）。以此作为后续测定调零或基线参考。（注：有些方案直接用此混合物对空气调零）。
  4. 样品测定管：
    • 另取1个石英比色皿，加入：
      • 工作混合液：980 μL (按上述示例)
      • 待测样品：20 μL (体积可根据酶活性调整，确保速率在线性范围内)
    • 轻轻混匀，放入恒温比色槽中，孵育2-3分钟使温度平衡。
    • 启动反应： 快速加入预冷的 草酰乙酸溶液（OAA, 15 mM）：33.3 μL (按上述示例)，立即用移液器吹打数次混匀（避免产生气泡），同时启动秒表。
  5. 吸光度监测：
    • 在340 nm波长下，连续监测吸光度（A₃₄₀）下降变化，持续1-3分钟（或至少6个有效数据点）。
    • 记录初始的快速变化（延滞期，几秒）结束后的一段线性下降期（通常≥30秒）内的吸光度随时间变化的数据（每隔10-30秒记录一次A₃₄₀和对应时间）。
  6. 终止反应（可选）： 如果采用固定时间终点法而非连续监测法，则在反应进行预设的精确时间（如1或2分钟）后，迅速加入终止液（如100 μL 6 M HCl）终止反应，然后读取此时的A₃₄₀。同时需设置相应的空白和样品空白管（加入样品但不加OAA，或加入OAA后立即终止）。推荐使用连续监测动力学法。
  7. 样品空白（可选但推荐）： 设置一个不含底物OAA的对照管。操作同步骤4，但在加入“底物”时，加入等体积的预冷Tris-HCl缓冲液代替OAA溶液。该管用于扣除样品中可能存在的其他消耗NADH的物质（如乳酸脱氢酶LDH）或背景干扰。计算时用样品管速率减去此空白管速率。

五、结果计算

  1. 计算反应速率：
    • 连续监测法： 以时间（t, min）为横坐标，吸光度（A₃₄₀）为纵坐标作图。在线性下降区间内，求取斜率（ΔA₃₄₀ / Δt）。此斜率绝对值（|ΔA₃₄₀ / min|）即为单位时间内吸光度的变化值（ΔA/min）。
    • 固定时间终点法： ΔA₃₄₀ = (A₀ - A<sub>t</sub>) - (A<sub>空白0</sub> - A<sub>空白t</sub>)。其中A₀和A<sub>空白0</sub>分别为样品管和空白管反应起始时的吸光度（或混合后即测的值），A<sub>t</sub>和A<sub>空白t</sub>为反应时间t时的吸光度。然后计算ΔA₃₄₀ / t (min)。
    • 扣除样品空白： 如果做了样品空白（步骤7），则样品管的净ΔA/min = |ΔA/min<sub>样品管</sub>| - |ΔA/min<sub>样品空白管</sub>|
  2. 计算酶活性： NADH在340 nm、光径1 cm时的摩尔消光系数（ε）为 6220 M⁻¹ cm⁻¹。
    • 酶活性定义为：在特定测定条件下（温度、pH），每分钟催化转化1 μmol NADH（生成1 μmol NAD⁺）所需的酶量。
    • 计算公式： 酶活性 (U/mL) = [(ΔA₃₄₀ / min) * V<sub>total</sub> (mL) * 1000] / [ε (M⁻¹ cm⁻¹) * d (cm) * V<sub>sample</sub> (mL)] 酶活性 (U/mg prot) = 酶活性 (U/mL) / 样品蛋白浓度 (mg prot/mL)
    • 参数说明：
      • ΔA₃₄₀ / min: 扣除空白后的净吸光度下降速率（绝对值）。
      • V<sub>total</sub>: 反应体系的总体积（单位：mL）。示例中为1.0 mL (1000 μL = 0.001 L)。
      • 1000: 将mol转换为μmol的换算因子（1 mol = 10⁶ μmol，公式中因体积单位用mL（对应10⁻³ L），与ε的M⁻¹（L mol⁻¹）单位结合，需乘以1000以得到μmol）。
      • ε: NADH在340nm的摩尔消光系数，6220 L mol⁻¹ cm⁻¹ (或 M⁻¹ cm⁻¹)。
      • d: 比色皿光径（cm），通常为1 cm。
      • V<sub>sample</sub>: 加入反应体系中的样品体积（单位：mL）。示例中为0.020 mL。
    • 简化公式： 对于标准1cm光径比色皿： 酶活性 (U/mL) = (ΔA₃₄₀ / min) * (V<sub>total</sub> / V<sub>sample</sub>) * (1000 / 6220) ≈ (ΔA₃₄₀ / min) * (V<sub>total</sub> / V<sub>sample</sub>) * 0.1608 示例代入（V<sub>total</sub>=1.0 mL, V<sub>sample</sub>=0.020 mL）: 酶活性 (U/mL) = (ΔA₃₄₀ / min) * (1.0 / 0.020) * 0.1608 ≈ (ΔA₃₄₀ / min) * 8.04

六、关键注意事项

  1. 试剂稳定性： NADH和草酰乙酸水溶液极不稳定。NADH易被空气氧化，草酰乙酸易脱羧生成丙酮酸。务必临用前配制，溶解于预冷的缓冲液，全程置于冰上避光操作。失效试剂会导致反应速率偏低或不反应。定期检查试剂有效性。
  2. 温度控制： 酶反应速率对温度敏感。必须确保分光光度计比色槽或水浴精确维持在设定温度（如25°C/30°C）并充分预热平衡。温度波动直接影响结果准确性。
  3. pH精确性： 缓冲液的pH对酶活性影响巨大。使用精确校准过的pH计配制缓冲液，并在实际反应温度下验证pH值（温度会影响pH）。
  4. 底物浓度： 确保反应体系中底物（NADH和草酰乙酸）的终浓度在饱和水平（通常≥10倍Km值），使反应为零级反应（速率只与酶浓度有关）。参考文献或做预实验确定合适浓度。示例中NADH约0.2 mM，OAA约0.5 mM是常见起始点。
  5. 酶量选择（样品稀释）： 样品需适当稀释，使反应初速率（ΔA₃₄₀/min）在线性范围内（通常0.01-0.1），且线性下降期足够长（≥1分钟）。速率过快（ΔA/min过大）表明酶过量，需稀释样品；速率过慢则可能需浓缩样品或延长监测时间。
  6. 混合充分： 加入最后一种试剂（通常是OAA）启动反应时，必须立即、充分混合均匀，避免局部浓度不均影响反应起始。
  7. 背景干扰： 样品中可能含有其他酶（如乳酸脱氢酶LDH）或物质消耗NADH或产生背景吸收。强烈建议设置不加底物OAA的“样品空白”管，以扣除这些背景干扰。确保空白速率（|ΔA/min<sub>空白</sub>|）远小于样品速率。
  8. 比色皿洁净： 使用前后彻底清洗石英比色皿，避免污染或残留气泡影响光路。确保比色皿外壁干燥无水渍。
  9. 线性范围确认： 反应进程曲线（A-t图）需有明显的线性下降段用于计算速率。初始快速变化（延滞期）和后期偏离线性（底物消耗过多）的数据点应排除。
  10. 结果报告： 清晰报告测定条件（温度、pH、底物终浓度）、计算方法、样品来源及处理方式、蛋白浓度测定方法（用于比活性计算）、最终活性单位（U/mL样品或U/mg prot）。

七、方法适用范围与意义

本分光光度法适用于多种生物样本（动植物组织、微生物、细胞培养物）中NAD-MDH活性的定量分析。该酶是三羧酸循环（TCA cycle）的关键酶之一，催化草酰乙酸还原为苹果酸，在细胞能量代谢（线粒体基质）、苹果酸-天冬氨酸穿梭（胞质与线粒体还原当量转运）以及C4植物光合碳同化等生理过程中发挥核心作用。准确测定其活性对于研究生物体能量代谢状态、环境胁迫响应、基因功能验证以及相关生理病理过程具有重要意义。