原料药中 DNA、蛋白质及糖类残留检测技术指南
在生物技术来源原料药（如重组蛋白、疫苗、核酸药物、细胞治疗产品等）的生产过程中，宿主细胞残留的 DNA、蛋白质以及工艺相关的糖类（如培养基成分、纯化添加剂）是必须严格监控的关键杂质。其残留水平直接影响药品的安全性（如免疫原性、致瘤性）和有效性。本指南旨在系统阐述原料药中此三类杂质残留检测的技术要点与验证要求。
一、 DNA 残留检测
- 检测意义： 残留宿主细胞 DNA 可能携带致癌基因或具有免疫刺激活性，存在潜在安全风险。各国药典及 ICH 指南均对其残留量有严格限定。
- 主流方法： 实时荧光定量 PCR (qPCR)
- 原理： 设计与宿主细胞基因组特异性结合的引物和探针。通过 PCR 扩增靶标 DNA 片段，实时监测荧光信号强度，其增长与初始模板 DNA 量成正比。通过与已知浓度的标准品对比，精确定量样品中残留 DNA 含量。
- 关键步骤与技术要点：
- 样品预处理： 根据原料药性质（溶液、冻干粉等）和基质复杂性，选择合适方法（如蛋白酶 K 消化、有机溶剂抽提、柱纯化）有效裂解细胞/病毒、释放 DNA 并去除干扰物质（如蛋白质、脂质、多糖、PCR 抑制剂）。
- 引物/探针设计： 靶向宿主细胞基因组中单拷贝或低拷贝数的特异性序列（如管家基因、单拷贝基因），确保高特异性。避免与产品基因或常见污染物发生交叉反应。需进行特异性验证。
- 标准品制备： 使用经准确定量的宿主细胞基因组 DNA 制备系列稀释的标准曲线。标准品应与待测样品经历相似的预处理步骤（模拟处理）。
- qPCR 反应体系优化： 优化引物/探针浓度、退火温度、循环数等参数，确保扩增效率（通常 90%-110%）和线性范围符合要求（通常覆盖 4-6 个数量级）。
- 数据分析： 根据标准曲线计算样品中 DNA 含量。需设置阴性对照（无模板对照，NTC）和阳性对照（低浓度标准品）。
- 方法验证关键参数：
- 特异性： 证明方法仅检测目标宿主 DNA，不扩增产品、其他可能污染物或空白基质。
- 准确度与精密度： 通过加标回收实验（在空白基质或样品中加入已知量宿主 DNA）考察回收率（通常要求 70%-130%）及重复性、中间精密度。
- 检测限(LOD)与定量限(LOQ)： 明确可可靠检出和定量的最低 DNA 浓度。LOD 通常为能稳定检出的最低浓度，LOQ 需满足精密度和准确度要求（如 RSD ≤ 25%，回收率 50%-150%）。
- 线性范围： 标准曲线在预期定量范围内应具有良好的线性关系（R² ≥ 0.98）。
- 耐用性： 考察关键参数（如退火温度、试剂批次）微小波动对结果的影响。
二、 蛋白质残留检测
- 检测意义： 残留宿主细胞蛋白质（HCP）是潜在的外源性免疫原，可能引起过敏反应或影响产品稳定性。需严格控制其残留水平。
- 主流方法：
- 酶联免疫吸附法 (ELISA)： 最常用，尤其适用于工艺开发和质量控制。
- 基于凝胶的方法： 如 SDS-PAGE（定性/半定量）、Western Blot（特异性鉴定），常用于辅助鉴定或调查。
- 色谱/质谱法： 如反相色谱结合高分辨率质谱 (RP-HPLC-MS/MS)，用于特异性 HCP 鉴定和定量（通常作为 ELISA 的补充）。
- ELISA 法详解：
- 原理： 利用多克隆或混合单克隆抗体（抗-HCP 抗体）捕获样品中的残留宿主蛋白，再通过酶标记的二抗进行检测，产生与 HCP 含量相关的颜色信号。
- 关键步骤与技术要点：
- 抗体的选择与制备： 使用覆盖尽可能多宿主蛋白（通常来自空宿主细胞或模拟生产工艺的杂质谱）的多抗或混合单抗（“鸡尾酒”抗体）。抗体需具有广谱性和高亲和力。抗体的质量（特异性、滴度、覆盖率）是方法成功的关键。
- 标准品： 使用代表性 HCP 混合物（如来自模拟生产工艺的空白运行或基因敲除宿主）制备，并尽可能准确定量（如通过凯氏定氮法、氨基酸分析）。
- 样品处理： 确保样品中的 HCP 处于可被抗体识别的状态（避免过度变性）。样品可能需要稀释以符合标准曲线范围并减少基质效应。
- 包被与封闭： 优化包被抗体浓度、封闭剂种类和封闭时间，以最大化信号背景比。
- 检测系统： 常用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗，配合相应底物显色。
- 方法验证关键参数：
- 特异性/选择性： 证明抗体主要结合 HCP，与产品本身或其他常见杂质交叉反应低。需考察产品及其相关杂质（如聚体、降解产物）的干扰。
- 准确度与精密度： 加标回收实验考察回收率和精密度（重复性、中间精密度）。
- 检测限(LOD)与定量限(LOQ)： 明确可检出和定量的最低 HCP 浓度。
- 线性范围： 标准曲线在预期定量范围内应具有良好的线性关系。
- 耐用性： 考察孵育时间/温度、洗液组分/次数等微小变化的影响。
- 钩状效应（Hook effect）： 高浓度 HCP 可能导致信号下降，需确定方法的动态范围上限。
三、 糖类残留检测
- 检测意义： 糖类残留可能来源于培养基（如葡萄糖、乳糖）、纯化添加剂（如甘油、蔗糖、山梨醇）、稳定剂或产品自身的糖基化修饰。过量残留可能影响产品稳定性、安全性（如渗透压）或引发免疫反应。
- 检测方法： 根据目标糖的性质（总糖、还原糖、特异性单糖）和检测需求选择。
- 总糖检测：
- 蒽酮-硫酸法： 原理是浓硫酸使糖类脱水生成糠醛衍生物，与蒽酮缩合产生蓝绿色化合物，在 620-630 nm 处有最大吸收。适用于检测葡萄糖、蔗糖、淀粉等多糖。操作简便，但专属性较差（对多种糖有响应），易受其他有机化合物干扰。
- 苯酚-硫酸法： 原理是糖类在浓硫酸作用下转化为糠醛衍生物，与苯酚缩合生成橙黄色化合物，在 480-490 nm 处比色测定。灵敏度较高，但也存在专属性问题。
- 还原糖检测：
- 3,5-二硝基水杨酸法 (DNS 法)： 原理是还原糖在碱性条件下加热，将黄色的 3,5-二硝基水杨酸还原成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸，在 540 nm 处测定吸光度。常用于半纤维素、纤维素酶活测定中的还原糖定量。专属性相对较好（针对还原糖）。
- 特异性单糖/糖醇检测：
- 高效液相色谱法 (HPLC)：
- 示差折光检测法 (RID)： 通用型检测器，基于溶液折光率变化，适用于无紫外吸收的糖类（如蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇）。灵敏度相对较低，对温度变化敏感。
- 蒸发光散射检测法 (ELSD)： 通用型检测器，基于雾化后溶质颗粒对光的散射。灵敏度通常优于 RID，对梯度洗脱兼容性好，是 HPLC 分析糖类的主流检测器。
- 色谱柱： 常用氨基柱、糖专用柱或阳离子交换柱（如钙型、铅型、氢型）。
- 离子色谱法 (IC) 结合脉冲安培检测 (PAD)： 对糖类具有高选择性和高灵敏度，特别适合复杂基质中多种单糖、双糖和糖醇的同时分离检测，是药典推荐方法之一（如 USP 中甘露醇、山梨醇的测定）。
- 高效液相色谱法 (HPLC)：
- 总糖检测：
- 方法选择与技术要点：
- 明确目标物： 首先需明确待检测的具体糖类（是总糖、还原糖还是特定的某一种或几种糖）。
- 样品前处理： 根据样品基质和目标糖性质进行必要的前处理，如去蛋白（三氯乙酸沉淀、超滤）、脱盐（固相萃取、透析）、稀释、过滤等，以去除干扰物质。
- 标准品： 使用高纯度的目标糖标准品。
- 色谱条件优化： 对于 HPLC/IC 法，需优化流动相组成、流速、柱温等参数以达到良好的分离效果。
- 方法验证关键参数： 同样需验证专属性、准确度（回收率）、精密度、线性范围、LOD/LOQ、耐用性。
四、 方法验证与质量保证
所有残留检测方法在用于原料药放行检验前，必须按照 ICH Q2(R1) 等法规指南要求进行完整的方法学验证。验证内容包括但不限于：
- 专属性/选择性： 证明方法能准确区分并定量目标分析物，不受样品基质及其他潜在共存物质的干扰。
- 线性： 在规定的浓度范围内，响应值与分析物浓度成比例关系。
- 准确度： 通过加标回收率实验评估，通常要求回收率在可接受范围内（如 80%-120%）。
- 精密度： 包括重复性（同一分析员、同一仪器、短时间间隔）和中间精密度（不同日期、不同分析员、不同仪器）。
- 检测限 (LOD) 与定量限 (LOQ)： 明确方法的最低检出能力和可靠定量的最低水平。
- 范围： 指能达到可接受的准确度、精密度和线性的浓度区间。
- 耐用性： 评估方法参数（如 pH、温度、流速、试剂批次等）发生微小、有意的变化时，方法保持有效的能力。
- 系统适用性： 根据方法特性设定测试参数（如色谱柱分离度、理论塔板数、拖尾因子、qPCR 扩增效率/标准曲线斜率/R² 值等），确保分析系统在运行时的性能符合要求。
五、 结语
原料药中 DNA、蛋白质和糖类残留的检测是确保生物技术产品安全性和有效性的重要环节。选择合适、经过充分验证的分析方法是获得可靠数据的基础。qPCR 法凭借其高灵敏度、高特异性成为 DNA 残留检测的金标准；ELISA 法因其高通量和较好的灵敏度被广泛用于 HCP 残留检测；糖类残留检测则需根据目标物特性在比色法、HPLC 和 IC 等方法中灵活选择。持续关注新技术发展（如数字 PCR、高分辨率质谱在 HCP 分析中的应用），并严格遵循法规要求和进行方法生命周期管理，是保证原料药质量可控的关键。