细菌内毒素检查方法学详解
细菌内毒素检查（BET）是药品、医疗器械及生物制品质量控制中至关重要的环节，用于检测或量化样品中革兰氏阴性菌产生的内毒素（主要为脂多糖）。其核心原理是利用鲎的变形细胞裂解物（鲎试剂）与内毒素发生特异性和灵敏的凝胶化或显色反应。本文将系统阐述该方法学的关键要素。
一、 基本原理
鲎试剂中含有的凝固酶原系统能被内毒素级联激活：
- 内毒素激活C因子：内毒素结合并激活C因子（一种丝氨酸蛋白酶原）。
- 级联放大：激活的C因子剪切并激活B因子，后者再激活凝固酶原。
- 凝胶形成（凝胶法）：激活的凝固酶催化凝固蛋白原转化为凝固蛋白，形成交联凝胶。
- 显色反应（光度法）：
- 终点显色法（比色法）：激活的凝固酶水解人工合成底物（如Boc-Leu-Gly-Arg-pNA），释放出黄色对硝基苯胺（pNA），在405nm处测定吸光度。
- 动态显色法（浊度法/显色法）：实时监测凝胶形成导致的浊度增加（浊度法）或显色底物水解导致的吸光度变化（显色法）。
二、 主要检查方法
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凝胶法
- 原理： 基于内毒素浓度达到或超过鲎试剂灵敏度（λ）时，引起凝胶形成的定性或半定量方法。
- 操作：
- 制备内毒素标准溶液系列（通常为2λ, λ, 0.5λ, 0.25λ）。
- 将等体积样品溶液/稀释液（供试品溶液）或标准溶液与鲎试剂混合。
- 在适宜温度（通常37°C ± 1°C）下孵育规定时间（如60±2分钟）。
- 缓慢倒转试管（一般为180°），观察凝胶是否形成：形成坚固凝胶（倒转时不破裂变形）判为阳性（+），未形成凝胶或形成松散絮状物判为阴性（-）。
- 结果判断：
- 限量试验： 检查供试品溶液是否超过规定的内毒素限值（L）。供试品溶液最大有效稀释倍数（MVD）下的浓度为不超过λ时，2支管均应为阴性（-）。
- 半定量试验： 通过系列稀释确定样品的内毒素大致浓度范围（端点浓度法）。
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光度测定法
- 原理： 定量测定内毒素引起的显色或浊度变化速率或程度。
- 方法类型：
- 终点显色法： 在反应终点（固定时间点）测定水解产物（如pNA）的吸光度。通过标准曲线计算浓度。
- 动态显色法/动态浊度法： 连续监测反应过程，记录吸光度（显色法）或浊度（浊度法）随时间的变化。当反应速率达到预定阈值（onset time法）或使用软件拟合反应曲线计算内毒素浓度。
- 操作关键：
- 建立标准曲线：使用至少3个浓度的内毒素标准溶液（覆盖预期样品浓度范围），每个浓度重复测试。
- 样品测试：将供试品溶液与鲎试剂混合，按选定的方法模式（终点/动态）进行孵育和检测。
- 结果计算： 根据标准曲线（通常为log-log线性关系），计算供试品溶液的内毒素浓度。需乘以稀释倍数得到原液浓度。
三、 方法学验证关键要素
为确保方法的准确性、可靠性和适用性，必须进行全面的验证：
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鲎试剂灵敏度复核 (λ确认)：
- 目的： 确认所用批次鲎试剂的实际灵敏度（λc）是否在标称值（λ）的0.5λ - 2.0λ范围内。
- 方法： 使用内毒素工作标准品（RSE/CSE）配制至少4个浓度（如2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ），每浓度平行4管（凝胶法）或至少2次重复（光度法）。
- 标准： 凝胶法：终点浓度（最低浓度阳性管）在0.5λ - 2.0λ范围；光度法：标准曲线相关系数|r| ≥ 0.980，回归方程符合要求。
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供试品干扰试验：
- 目的： 确认样品溶液（或其指定浓度/稀释度）在检测条件下不抑制或增强鲎试剂的反应。
- 方法：
- 凝胶法干扰预试验（可选）： 初步确定最大无抑制浓度（MIC）或最小有效稀释倍数（MVD起点）。
- 标准干扰试验（核心）：
- 系列A (标准对照)： RSE/CSE溶于检查用水。
- 系列B (含供试品的标准)： RSE/CSE溶于未检出内毒素的供试品溶液（或其指定浓度/稀释度）。
- 系列C (供试品对照)： 未检出内毒素的供试品溶液（或其指定浓度/稀释度）溶于检查用水。
- 系列D (阴性对照)： 检查用水。
- 结果判定标准：
- 凝胶法： 系列A和系列B的终点浓度（几何平均）应在0.5λ - 2.0λ范围内，且系列A与系列B的终点浓度比值应在0.5 - 2.0范围。系列C和D应为阴性。
- 光度法： 系列B的校正标准曲线（log内毒素浓度 vs log反应时间或反应值）的斜率与系列A相比应在0.8 - 1.2范围内（动态法）或在0.9 - 1.1范围内（终点法），且相关系数|r| ≥ 0.980。系列C的内毒素回收率应在50%-200%范围内（若需定量）。
- 干扰处理： 若存在干扰，处理方法包括：进一步稀释样品（不超过MVD）、调节pH值（通常6.0-8.0）、过滤、加入二价阳离子螯合剂（如Mg²⁺）或使用特定干扰去除试剂盒等，并重新进行干扰试验确认有效性。
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最大有效稀释倍数 (MVD) 计算：
- 公式： MVD = (L × C) / λ
- L： 供试品的细菌内毒素限值（EU/mL, EU/mg, EU/Unit）。
- C： 供试品溶液的浓度（单位/mL, mg/mL, Unit/mL）。若为原液，C=1。
- λ： 所用鲎试剂的标示灵敏度（EU/mL）。
- 意义： 定义了样品可被稀释的最高倍数，在此倍数下，按公式计算出的内毒素浓度等于限值L时，刚好能被检测出（凝胶法为阳性，光度法可定量）。
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最小有效浓度 (MVC) - 凝胶法专用：
- 概念： 在未稀释的供试品溶液中，进行干扰预试验确定的不产生抑制/增强作用的最高浓度（或最低稀释倍数）。
- 作用： 确定进行正式凝胶法干扰试验的供试品浓度起点。
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样品制备与溶液配制：
- 所有容器需经充分灭菌（如250°C干热≥30min或充分验证的其他方法）以去除外源性内毒素。
- 使用细菌内毒素检查用水（BET水）进行溶解和稀释。
- 内毒素工作标准品溶解后用旋涡混合器充分振荡（通常≥15分钟），室温静置（通常≥15分钟）后使用。
- 供试品溶液按处方或规定方法配制，避免引入外源性内毒素。
四、 方法选择与比较
- 凝胶法：
- 优点： 设备简单、成本低、操作简便、特异性好。尤其适合常规限量检查、颜色深或浑浊的样品（需确认无干扰）、资源有限或样品量大的情况。
- 缺点： 灵敏度相对较低（通常0.03-0.5 EU/mL）、结果主观（目视判断）、只能定性或半定量、通量低、无法获取精确浓度值。
- 光度测定法：
- 优点： 灵敏度高（可达0.001 EU/mL）、结果客观、可精确定量、自动化程度高、通量高、可实时监测反应动力学。
- 缺点： 设备昂贵、操作相对复杂、对颜色深或浑浊、粘度高的样品干扰更敏感（需有效去除）、运行成本相对较高。
五、 常见问题与注意事项
- 污染控制： 严格无菌操作，使用合格容器和试剂（低内毒素），确保实验环境清洁。
- pH值影响： 反应最适pH为6-8。样品pH超出范围时需用酸/碱（如HCl/NaOH）或缓冲液调节，并验证调节过程不影响内毒素回收或引入干扰。
- 温度与时间控制： 精确控制孵育温度（±1°C）和反应时间，对结果重现性至关重要（尤其凝胶法）。
- 混合充分： 加样后需轻柔并充分混合（如涡旋），避免产生气泡。
- 试剂储存与复溶： 严格按说明书要求储存（通常2-8°C）和使用鲎试剂及标准品，溶解后稳定性有限（遵循说明书）。
- 标准品使用： RSE/CSE需用前临时稀释配制，避免反复冻融。
- 样品前处理： 对于复杂样品（如含蛋白、盐类、有机溶剂等），需优化前处理方案消除干扰。
- 结果解读： 凝胶法判读需严格遵守标准（如倒转180°）；光度法需确保标准曲线符合要求，样品浓度在曲线范围内。
结论
细菌内毒素检查是保障注射类产品安全性的关键质控手段。深入理解鲎试验原理，熟练掌握凝胶法和光度法的操作、验证（尤其是灵敏度复核和干扰试验）及结果判定标准，严格控制实验条件并有效消除干扰，是获得准确可靠结果的基石。方法的选择需根据产品特性、限值要求、实验室条件及法规要求综合考量。持续关注药典（如USP<85>/EP 2.6.14/ChP 1143）的更新，严格遵循其规定，是确保合规性的前提。
重要声明：
- 本文所提供的信息旨在阐述细菌内毒素检查方法学的通用原理和要求。
- 具体实验参数的设置（如孵育时间、温度、鲎试剂用量）必须严格遵循所选用鲎试剂产品的说明书以及**现行有效的药典（如《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》）**的相关规定。
- 任何偏离药典或试剂说明书的方法均需经过充分且严谨的验证方可使用。