四氯化碳诱导的肝纤维化模型 - 中析研究所生物检测中心

四氯化碳诱导的肝纤维化模型：原理、建立与应用

肝纤维化是多种慢性肝病进展的核心病理过程，其特点是细胞外基质（ECM）的过度沉积。建立可靠且可控的实验动物模型对于深入研究肝纤维化的发病机制、评估潜在治疗方法至关重要。四氯化碳（CCl₄）诱导模型因其高重现性、病理特征与人类疾病相似而被广泛应用。

一、模型建立的基本原理

四氯化碳本身对肝脏具有直接的细胞毒性。其核心毒性机制在于：

肝脏代谢激活： 主要在肝细胞滑面内质网中，由细胞色素 P450 2E1（CYP2E1）代谢生成高活性的三氯甲基自由基（•CCl₃）和三氯甲基过氧自由基（•OOCCl₃）。
脂质过氧化： 这些自由基攻击细胞膜上的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化链式反应，破坏细胞膜完整性。
共价结合： 自由基与细胞内蛋白质、核酸、脂质等大分子发生共价结合，干扰其正常功能。
钙稳态失衡与线粒体损伤： 导致细胞内钙离子超载，线粒体膜电位下降，能量产生障碍，最终诱导肝细胞坏死或凋亡。
炎症反应与星状细胞活化： 肝细胞损伤释放损伤相关分子模式（DAMPs），激活库普弗细胞（肝巨噬细胞），释放大量促炎因子（如 TNF-α, IL-1β, IL-6）和趋化因子。持续的炎症微环境是肝星状细胞（HSCs）活化的关键驱动力。活化的 HSCs 转化为肌成纤维样细胞，丧失维生素 A 脂滴，大量增殖、迁移，并成为产生 ECM（尤其是 I 型和 III 型胶原）的主要细胞来源。同时，组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）表达上调，基质金属蛋白酶（MMPs）活性受抑，导致 ECM 降解减少。
纤维化形成： 持续的肝细胞损伤、炎症和 HSC 活化，最终导致 ECM 过度累积，破坏肝脏正常结构，形成纤维间隔，逐步发展为肝纤维化甚至肝硬化。

二、模型建立的关键步骤与方法

实验动物选择：
- 常用物种： 大鼠（SD、Wistar 等品系使用最广泛）、小鼠（C57BL/6 等品系）。
- 选择依据： 品系对 CCl₄ 敏感性、操作便利性、成本、研究目的（基因修饰模型常用小鼠）。雄性动物通常更常用。
四氯化碳给药方案：
- 溶剂： CCl₄ 通常用中性载体（如橄榄油、玉米油、矿物油）稀释，降低局部刺激。常见的稀释比例为 10-50% (v/v)。
- 给药途径：
  - 腹腔注射 (i.p.)： 最常用方式。操作简便，吸收相对稳定。
  - 皮下注射 (s.c.)： 吸收较慢，可减少急性毒性反应。
  - 灌胃 (p.o.)： 较少用，受胃肠道吸收变异影响较大。
- 给药剂量与频率： 这是模型成败的关键，需根据不同动物种类、品系、体重、实验目标（急性损伤或慢性纤维化）精心优化。
  - 急性肝损伤： 单次高剂量注射（如大鼠：1-2 mL/kg 油溶液，浓度取决于目标）。
  - 慢性肝纤维化/肝硬化：
    - 常用方案： 每周 2-3 次腹腔注射。诱导纤维化起始剂量大鼠通常为 0.5-2 mL/kg（浓度多为 10-50%），小鼠为 0.1-0.5 mL/kg（浓度多为 10-20%）。后续可能需要根据动物反应（体重下降、死亡率）和检测指标进行调整。
    - 周期： 一般需要 4-12 周持续给药才能形成显著的纤维化。肝硬化模型可能需要更长时间（如 8-16 周）。
- 剂量调整： 密切观察动物状态（活动度、毛发、精神状态）、体重变化及死亡率是必要的。若体重下降过快（如超过初始体重的 20%）或死亡率过高，应及时降低剂量或延长给药间隔。
对照组设置：
- 空白对照组： 仅给予等体积溶剂（如橄榄油）。
- 溶剂对照组： 至关重要，以排除溶剂本身可能的生理效应。
- 阳性药物对照组（若评估药物）： 使用公认有效的抗纤维化药物。

三、模型评价指标

大体形态观察：
- 肝脏体积、质地、色泽（纤维化后期常为黄褐色、表面颗粒状凹凸不平、边缘变钝）、有无结节（肝硬化）。
- 肝脏指数（肝重/体重比）：通常升高。
血清生化指标： 反映肝细胞损伤程度。
- 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）：显著升高。
- 总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）：可能升高，尤其在损伤严重或胆汁淤积时。
- 白蛋白（ALB）：合成功能下降时降低。
- 透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原肽（PIIIP）、IV型胶原（CIV）：血清纤维化标志物，水平常升高。
组织病理学评估（金标准）：
- 染色方法：
  - 苏木精-伊红 (HE)： 观察肝细胞损伤（变性、坏死）、炎症细胞浸润、结构紊乱。
  - 马松三色 (Masson’s Trichrome)： 最常用，将胶原纤维染成蓝色/绿色，清晰显示纤维间隔和纤维化程度。
  - 天狼星红 (Sirius Red)： 胶原特异性强，在偏振光下可区分 I 型（强双折光，红/黄色）和 III 型（弱双折光，绿色）胶原。
  - 网状纤维染色： 显示网状支架结构塌陷。
- 纤维化分期系统： 常用半定量评分系统评估纤维化严重程度。
  - Scheuer 系统
  - Ishak 系统
  - METAVIR 系统（尤其适用于啮齿类动物）：
    - F0：无纤维化。
    - F1：汇管区纤维性扩大。
    - F2：汇管区周围纤维化，少量纤维间隔形成。
    - F3：大量纤维间隔形成，结构紊乱，无肝硬化。
    - F4：肝硬化。
- 计算机辅助图像分析： 对天狼星红或马松染色切片进行胶原面积百分比定量，提供更客观数据。
分子生物学检测： 深入探究机制。
- mRNA 水平： qPCR 检测纤维化相关基因表达（如 Collagen I (Col1a1), Collagen III (Col3a1), α-SMA (Acta2), TGF-β1, TIMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13）。
- 蛋白水平：
  - 免疫组织化学 (IHC)：定位关键蛋白在组织中的表达（如 α-SMA - HSCs 活化标志； Collagen I）。
  - 蛋白质印迹 (Western Blot)：定量检测组织中目标蛋白表达量。
  - 酶联免疫吸附试验 (ELISA)：检测血清或组织中特定因子（如 TGF-β1, TNF-α）浓度。

四、模型的优势与局限性

优势：
1. 纤维化程度高且稳定： 可诱导出显著的肝纤维化甚至肝硬化。
2. 病理特征与人类相似： 包括肝细胞坏死、小叶炎症、星状细胞活化、桥接纤维化及假小叶形成。
3. 操作相对简便： 技术难度不高。
4. 成本效益较高： 主要试剂成本可控。
5. 研究机制成熟： 大量文献基础，便于结果比较。
6. 适用于药物筛选： 广泛用于评价抗纤维化药物的疗效和机制。
局限性：
1. 毒性机制差异： CCl₄ 的毒性是直接化学损伤，与人类常见的病毒性、酒精性、代谢性脂肪性肝病的起始病因不同。
2. 急性损伤显著： 模型早期伴随强烈的肝细胞坏死和炎症，可能掩盖或混淆对纤维化本身的研究。
3. 个体差异与死亡率： 动物对 CCl₄ 敏感性存在个体差异，剂量控制不当易导致高死亡率。
4. 非特异性炎症： 强烈的炎症反应可能主导某些表型。
5. 停药后纤维化可逆性： 停止给药后，动物肝纤维化可能出现一定程度的自发逆转，这在人类晚期纤维化/肝硬化中较少见。
6. 剧毒性与安全风险： CCl₄ 对操作者和环境均有剧毒（致癌性、肝毒性、肾毒性），需在通风橱内严格防护操作，废弃物需专门处理。

五、实验注意事项与伦理考量

安全第一： 全程在通风良好的化学通风橱内操作 CCl₄，佩戴合适手套（如丁腈手套）、护目镜和实验服。避免皮肤接触和吸入蒸气。严格按规定处理污染废弃物。
剂量优化至关重要： 必须进行预实验，根据动物品系、来源、体重、饲养条件等摸索合适的初始剂量和调整策略，平衡纤维化诱导效果和高死亡率风险。
动物福利： 严格遵守实验动物伦理规范（遵循“3R”原则：替代、减少、优化）。
- 减少： 使用合理样本量。
- 优化： 精心设计实验方案减轻动物痛苦（如选择合适给药途径、频率、剂量；提供舒适环境；及时处理垂死动物）。
- 密切监测动物健康状况（体重、活动度、毛发、有无腹水、有无垂死表现），建立明确的人道终点标准（如体重下降 >20%，严重倦怠，无法获取食物/水），及时实施安乐死。
设立严格对照组： 特别是溶剂对照组，以排除非特异性效应。
组织样本处理规范： 肝脏取材位置应标准化（常取左叶或中叶），固定液（通常为 10% 中性福尔马林）需足量且及时固定，以保证后续病理染色质量。

六、结论

四氯化碳诱导的肝纤维化模型是研究肝纤维化发病机制和筛选评价抗纤维化药物的强有力工具。其核心价值在于能高效、稳定地在较短时间内模拟出人类肝纤维化的核心病理特征——肝星状细胞活化及细胞外基质的过度沉积。理解其诱导机制（CYP2E1 代谢、氧化应激、炎症、HSC 活化）、熟练掌握建模的关键技术（动物选择、剂量方案优化、安全操作）、并运用全面的评价体系（尤其是组织病理学金标准）对于获得可靠、可重复的研究结果至关重要。

然而，研究者必须清醒认识到该模型在病因学（化学损伤 vs 人类常见病因）和疾病进程（伴随显著急性炎症、停药后可逆性）方面存在的局限性。严格遵守实验室安全和实验动物伦理规范是该模型成功应用不可或缺的前提条件。在选择模型时，应充分考虑研究的具体目标，有时将 CCl₄ 模型与其他病因模型（如胆管结扎、酒精、高脂饮食/MCD/NASH 模型）相结合，或利用基因修饰动物，能更全面地揭示肝纤维化的复杂本质。