胆管结扎法构建肝纤维化大鼠模型：原理与方法
肝纤维化是多种慢性肝损伤的共同病理结局，其研究依赖于可靠的动物模型。胆管结扎（Bile Duct Ligation, BDL）因其操作相对明确、病理进展典型，成为建立肝纤维化大鼠模型的经典方法。本文旨在阐述BDL模型构建的核心原理与标准化操作流程。
一、模型构建原理
胆管结扎通过物理性阻断胆总管，导致胆汁无法正常流入十二指肠而在肝内淤积。胆汁淤积引发复杂病理级联反应：
- 胆汁酸毒性：积聚的疏水性胆汁酸直接损伤胆小管上皮细胞及肝细胞。
- 炎症反应：受损细胞释放损伤相关分子模式（DAMPs），激活Kupffer细胞，招募中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞浸润，释放大量促炎因子（如TNF-α, IL-1β, IL-6）。
- 氧化应激：胆汁酸的积累和炎症反应导致活性氧（ROS）大量产生，破坏细胞膜和线粒体功能。
- 肝星状细胞活化：以上因素共同刺激静息状态的肝星状细胞（HSCs）转化为增殖旺盛、分泌大量细胞外基质（主要为I型和III型胶原）的肌成纤维样细胞。
- 纤维间隔形成：大量沉积的胶原纤维在肝小叶内及门脉区间形成桥接纤维间隔，最终导致肝纤维化、肝硬化。
二、实验材料与动物准备
- 实验动物：健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）或Wistar大鼠（通常体重200-250g）。雄性大鼠使用更普遍，可避免雌激素周期对胆汁酸代谢和纤维化进程的可能影响。
- 主要器械与耗材：小动物手术台、动物剃毛器、碘伏消毒液、无菌手术器械包（手术刀柄及刀片、眼科剪、眼科镊或显微镊、持针器、缝合针线）、无菌纱布棉球、无菌手套、口罩帽子。
- 麻醉与镇痛药品：戊巴比妥钠溶液（或异氟烷吸入麻醉系统）、布托啡诺（术前及术后）。
- 其他试剂：生理盐水、肝素化生理盐水（可选，用于冲洗腹腔）、抗生素溶液（可选，用于术中冲洗）。
- 动物饲养：实验前大鼠适应性饲养至少一周，自由饮食饮水。术前12小时禁食不禁水。
三、手术操作流程（关键步骤）
- 术前准备：
- 大鼠称重，腹腔注射戊巴比妥钠（通常40-50 mg/kg）进行全身麻醉，确保麻醉深度适宜（痛觉反射消失）。
- 麻醉后，腹面朝上固定于37°C恒温手术台上。
- 剃除腹部中线区域（剑突至耻骨联合）毛发，碘伏消毒液由内向外环形消毒皮肤三次，铺无菌洞巾。
- 术前30分钟腹腔注射布托啡诺（1-2 mg/kg）进行超前镇痛。
- 腹部切口：
- 沿腹正中线（白线）作一纵行切口，长度约3-4 cm（剑突下1cm至脐上）。
- 逐层钝性分离皮下组织及肌肉层，避免损伤腹腔脏器。
- 轻柔提起腹白线两侧腹膜，剪开一小口后沿切口方向延伸打开腹腔。
- 胆总管定位与游离：
- 湿盐水纱布覆盖肠管并轻柔地向左侧牵拉，充分暴露肝门区域（肝脏与十二指肠之间的三角区域）。
- 在肝门处清晰辨识胆总管：呈淡黄色、半透明、壁薄、直径约1-2mm的管状结构，通常位于门静脉腹侧偏右，与肝动脉伴行。
- 用细钝头眼科镊或显微镊仔细游离胆总管中段（通常在肝总管汇合处与胰管汇入处之间），剥离周围疏松结缔组织约5mm，避免损伤伴行的门静脉及肝动脉（至关重要！可用生理盐水浸润帮助分离）。
- 胆管结扎与离断：
- 用4-0或5-0不可吸收无菌丝线（如丝线），在游离好的胆总管下方轻柔穿过两根缝线，两线间距约3-4mm。
- 先结扎靠近十二指肠侧的胆总管（远端结扎）。
- 再结扎靠近肝脏侧的胆总管（近端结扎）。
- 在两根结扎线之间，用无菌眼科剪横向剪断胆总管。
- 检查断端有无胆汁泄漏及结扎线是否牢固。
- 关腹：
- 确认无活动性出血。
- 使用无菌温生理盐水轻柔冲洗腹腔（约3-5ml，可选）。
- 逐层连续缝合腹壁肌肉层和腹膜层（常用3-0或4-0可吸收缝线）。
- 间断缝合或皮内缝合皮肤切口（用不可吸收或可吸收缝线）。再次消毒皮肤。
- 假手术组（Sham）操作：
- 除不游离、不结扎、不切断胆总管外，其余操作步骤（麻醉、开腹、暴露肝门、关腹）完全相同。这是评估手术创伤本身影响及模型特异性的关键对照。
四、术后护理
- 保温与苏醒：大鼠置于37°C恒温垫或红外灯下保温，直至完全苏醒（通常1-2小时）。苏醒后放入清洁、温暖、干燥的单独笼位。
- 镇痛管理：术后连续3-5天，腹腔注射布托啡诺（每日1-2次，剂量同术前）。密切观察大鼠疼痛表现（蜷缩、被毛竖立、活动减少、攻击性增加、食欲下降）。
- 补液与支持：苏醒后立即提供葡萄糖生理盐水或等渗盐水自由饮用。术后早期可考虑皮下注射适量温生理盐水（5-10ml）。确保易于获取的软质饲料（如湿润的常规饲料糊或营养凝胶）。
- 伤口观察与抗生素（可选）：术后7-10天每日检查切口有无红肿、渗出或开裂。通常无需常规使用抗生素，但若手术污染风险高或动物状态差，可酌情使用。
- 日常观察：密切监测体重、进食饮水、活动状态、尿液颜色（BDL大鼠尿液呈深黄/褐色）、粪便颜色（BDL大鼠粪便逐渐变浅至灰白色）。及时移除死亡动物。
五、模型评价与验证
BDL术后肝纤维化进展迅速且可预测：
- 时间进程：
- 术后3-7天：急性胆管炎、胆管增生、门脉区炎症浸润。
- 术后14天：显著的门脉区纤维化及少量桥接纤维间隔形成。
- 术后21-28天：广泛桥接纤维化，假小叶结构初步形成（肝硬化早期）。
- 验证方法：
- 生化指标：血清检测总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）显著升高；谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）中度升高；白蛋白（ALB）后期可能降低。
- 组织病理学（金标准）：
- 苏木精-伊红（H&E）染色：观察肝脏结构破坏、胆管增生、炎症细胞浸润、坏死区域。
- 天狼星红（Sirius Red）染色：特异性染色胶原纤维（I、III型胶原呈红色），可直观显示胶原沉积的位置、范围和程度，并进行胶原面积定量分析（影像分析软件）。
- Masson三色染色：胶原纤维呈蓝色，亦可评估纤维化程度。
- 羟脯氨酸含量测定：定量测定肝脏组织中胶原蛋白的主要成分羟脯氨酸含量，反映胶原总量。
- 纤维化相关基因/蛋白表达：检测如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，活化的HSC标志物）、胶原I（Col1a1）、胶原III（Col3a1）、转化生长因子β1（TGF-β1）等在肝脏中的表达水平（mRNA或蛋白）。
六、模型优势与局限性
- 优势：
- 病理机制明确：模拟胆汁淤积诱导的肝纤维化（如原发性胆汁性胆管炎PBC、原发性硬化性胆管炎PSC、胆道闭锁）。
- 病变进程快速、显著且可重复。
- 纤维化程度与时间呈正相关，方便不同阶段研究。
- 技术相对标准化，易于。
- 局限性：
- 高死亡率：术后2-4周死亡率较高（常>30%），主要死于胆管破裂、腹膜炎、内毒素血症、严重肝功能衰竭。
- 手术技术要求较高：需精细操作避免损伤血管（尤其是门静脉）。
- 病理特点：主要呈现胆管增生和门脉周围纤维化，早期即伴有显著炎症和黄疸，与病毒性肝炎、酒精性肝病等导致的纤维化模式存在差异。
- 并发感染风险：胆汁淤积增加肠源性细菌和内毒素易位风险。
- 假手术组对照必不可少：手术创伤本身可能引起轻微炎症和纤维化反应。
七、注意事项与伦理
- 严格无菌操作：最大限度降低术后感染风险。
- 精细解剖：游离胆总管时动作务必轻柔准确，避免撕裂血管导致大出血（致命性）。
- 充分镇痛：手术是重大应激源，充分的围术期镇痛是动物福利的基本要求。
- 术后精心护理：保温、补液、营养支持对动物存活至关重要。
- 定期监测与及时干预：密切观察动物状态，对濒死动物实施人道终点安乐死（如CO2吸入麻醉后颈脱臼）。
- 伦理审批：所有动物实验操作必须事先获得所在机构的动物实验伦理委员会（IACUC）的审查和批准，遵循“3R原则”（减少、优化、替代）。
总结
胆管结扎术是通过人为制造胆汁淤积有效诱导大鼠肝纤维化的经典方法。成功构建该模型的关键在于熟练掌握手术技术、严格无菌操作、提供完善的术后护理（尤其镇痛与支持治疗）以及设立合理的假手术对照组。尽管存在死亡率较高、手术技能要求高等局限性，BDL模型在阐明胆汁淤积性肝纤维化病理机制及评价潜在治疗策略方面仍具有不可替代的价值。研究者需始终将动物福利置于首位，严格遵循伦理规范进行操作。