大鼠脊髓半横断模型：操作、评估与应用指南
引言 脊髓损伤（SCI）是一种毁灭性的神经系统疾病，常导致永久性功能障碍。建立有效的动物模型是理解损伤机制和探索治疗策略的基础。大鼠脊髓半横断模型（Unilateral Hemisection Model） 因其操作相对可控、损伤程度一致、可模拟单侧功能障碍等特点，成为研究脊髓损伤后神经可塑性、轴突再生、细胞治疗及康复训练的重要工具。
模型价值与优势
- 单侧特异性： 造成明确的单侧运动、感觉功能障碍，便于进行损伤侧与健侧的自身对照研究。
- 损伤一致性高： 手术操作相对标准化，可产生具有高度可重复性的局限性损伤。
- 清晰对照： 健侧脊髓可作为理想的内部对照，减少个体差异影响。
- 适用性强： 广泛用于研究皮质脊髓束（CST）、红核脊髓束（RST）、感觉上行通路等特定通路的损伤与再生，以及跨半球重组等神经可塑性机制。
- 行为学评估明确： 单侧后肢功能障碍可通过特定行为学测试（如足印分析、网格行走、BBB评分子项）进行量化评估。
实验动物选择
- 常用品系： Sprague-Dawley (SD)、Long-Evans、Wistar 大鼠最常用，因其体型适中、性情相对温顺、对SCI研究背景数据丰富。
- 性别与年龄： 通常选用成年雄性大鼠（体重220-280g），以避免雌性激素周期对结果的影响。根据研究目的，也可选用雌性或不同年龄段的动物。
- 饲养环境： 标准SPF级动物房，12小时光暗循环，自由饮水进食。术前适应性饲养至少1周。
手术操作流程（关键步骤详解）
-
术前准备：
- 麻醉： 推荐使用吸入性麻醉（如异氟烷），便于调控麻醉深度。腹腔注射麻醉（如氯胺酮/赛拉嗪混合液）亦可。
- 备皮与消毒： 背部T7-T12区域剃毛，碘伏和酒精交替消毒皮肤。
- 体位固定： 俯卧位固定于恒温手术台（37°C），保持脊柱稳定。
- 眼膏防护： 涂抹眼膏防止角膜干燥。
- 术中监护： 监测呼吸频率和趾垫颜色。
-
椎板切除与暴露脊髓：
- 皮肤切口： 沿背部正中线，以T10棘突为中心，纵向切开皮肤约2-3cm。
- 分离肌肉： 钝性分离脊柱两侧的椎旁肌，充分暴露T9-T11椎骨的棘突和椎板。
- 椎板切除： 使用精细咬骨钳小心咬除T10椎板及部分相邻椎板，暴露硬脊膜。操作需极其轻柔，避免震动损伤脊髓。充分止血（骨蜡或明胶海绵）。
-
脊髓半横断损伤：
- 识别中线： 在手术显微镜下，清晰辨识脊髓背侧正中静脉（可作为中线标志）。
- 切开硬脊膜： 使用尖头显微剪刀或注射器针头，在脊髓背侧正中线稍偏向一侧（计划损伤侧）纵向切开硬脊膜约3-4mm。
- 脊髓半切：
- 经典方法（锐性切割）： 使用锋利的显微剪刀（如虹膜剪）或显微手术刀片，在预定损伤平面（通常为T10水平），从中线旁开始，垂直向下切割脊髓，深度延伸至腹侧软脊膜或中央管附近，并向头尾端延伸约1.5-2mm，形成一个楔形或矩形缺损。确保同侧皮质脊髓束（位于背外侧索）完全离断。
- 替代方法（吸取法）： 连接于负压装置的精细玻璃吸管（尖端直径约0.2-0.3mm），置于脊髓侧面预定损伤部位，轻柔吸除脊髓组织至所需深度和范围（通常深约1.5mm，头尾长约1.5-2mm）。
- 关键操作要点：
- 精确控制损伤侧别和节段。
- 避免损伤对侧脊髓和腹侧主要血管（如前脊髓动脉）。
- 操作轻柔，避免牵拉或挤压损伤邻近组织。
- 确认损伤： 可见同侧脊髓组织缺损，中央管结构可能暴露或被破坏，同侧背外侧索（皮质脊髓束主要走行区）完全切断。少量出血可用小块明胶海绵轻压止血。
-
关闭切口：
- 硬膜处理： 可原位缝合硬膜（困难）或保持开放（更常用）。
- 肌肉缝合： 使用可吸收缝线（如4-0 Vicryl）分层缝合椎旁肌。
- 皮肤缝合/闭合： 使用不可吸收缝线（如4-0 Nylon）或皮肤缝合夹闭合皮肤切口。
术后护理与管理（至关重要）
- 恢复与保温： 动物置于温暖、安静的单独笼盒中恢复，直至完全清醒。
- 抗生素预防： 术后连续3-5天注射抗生素（如头孢唑林）。
- 镇痛管理： 术后至少连续3天给予有效镇痛药（如布托啡诺、卡洛芬或美洛昔康）。
- 膀胱护理（关键）：
- 术后早期（至少1-2周），大鼠常出现排尿困难（尿潴留）。
- 必须每日进行膀胱按摩排尿（每天2-3次），直至自主排尿功能恢复。膀胱充盈易导致尿路感染甚至膀胱破裂死亡。
- 营养与水分： 提供软质饲料（如湿润的饲料颗粒或营养凝胶）和充足饮水。必要时可皮下注射生理盐水补充液体。
- 褥疮预防： 使用柔软的垫料，定期检查受压部位皮肤（尤其是后肢）。
- 一般观察： 每日监测体重、切口愈合、精神状态、有无感染迹象及自主排尿恢复情况。
模型有效性评估
-
行为学评估（评价功能障碍与恢复）：
- BBB运动评分量表： 评估开放场地中后肢运动功能（关节活动、躯干稳定性、协调性、步态等）。虽然为双侧评估，但可观察损伤侧后肢的特定缺陷（如拖行、足旋转、足背行走）。
- 网格行走测试： 大鼠在金属网格上行走，记录损伤侧后肢的踏空次数百分比，是评估肢体精细运动协调性和本体感觉的敏感指标。
- 足印分析：
- 步基宽度： 损伤侧后肢与对侧后肢或前肢的距离常增宽。
- 足旋转角度： 损伤侧后肢足部外旋角度增大。
- 步长/步幅： 损伤侧后肢步长可能缩短。
- 足部拖拽： 观察是否存在足趾拖地现象。
- 斜面爬行测试： 评估后肢承重和力量。
- 单侧感觉测试（可选）： 如触觉刺激回缩反射、热板或冷板测试（针对损伤侧肢体）。
-
组织学与形态学评估（验证损伤程度与病理变化）：
- 灌注固定与取材： 实验终点时，经心灌注生理盐水后，用多聚甲醛固定脊髓。取出包含损伤区（T10）及上下节段（如T8-T12）的脊髓组织。
- 切片与染色：
- 常规染色（HE, Nissl）： 观察损伤空腔大小、形态、炎症细胞浸润、神经元丢失（如损伤同侧前角运动神经元）、胶质瘢痕形成。
- 免疫组织化学/免疫荧光染色：
- 胶质细胞活化： GFAP（星形胶质细胞疤痕），Iba1/CD68（小胶质/巨噬细胞激活）。
- 轴突损伤/再生标志物： βIII-tubulin (神经元/轴突), NF200 (神经丝，成熟轴突), GAP43 (轴突发芽/再生), 逆行追踪（如BDA, CTB注射于损伤平面以下或运动皮层，标记特定下行通路如CST）。
- 神经元标志物： NeuN (神经元核抗原)。
- 血管/炎症： CD31 (血管内皮), CD11b/c (髓系细胞)。
- 特殊染色： Luxol Fast Blue (LFB) 染色髓鞘，评估脱髓鞘程度。
- 损伤范围确认： 必须通过组织学切片（通常冠状面或矢状面切片）确认损伤严格限于单侧，且达到预定深度（完全切断目标白质束），对侧结构完整。这是模型有效性的核心证据。
模型局限性
- 不完全模拟临床： 临床SCI多为挫伤或压迫性，半横断模型是锐性损伤，炎症和继发性损伤机制存在差异。
- 单侧局限性： 虽便于对照，但与临床常见的双侧功能障碍不完全相符。
- 手术操作挑战： 精确、一致地造成完全性单侧损伤而不累及对侧或导致意外全横断需要熟练技术。
- 术后护理强度大： 膀胱管理等人为干预强度高。
- 种属差异： 大鼠神经再生能力与通路（如CST走行）与人类存在差异，结论外推需谨慎。
应用领域
- 轴突再生研究： 评估药物、基因治疗、细胞移植对特定下行（如CST, RST）或上行感觉通路轴突再生的影响。
- 神经保护研究： 测试干预措施减少继发性损伤（如神经元死亡、炎症扩散、脱髓鞘）的效果。
- 神经可塑性研究： 探究损伤后健侧通路代偿、同侧残存通路重塑、皮质重组等机制。
- 康复训练研究： 评价强制性运动疗法、跑步机训练、电刺激等物理疗法对功能恢复的促进作用及机制。
- 神经修复材料研究： 测试生物支架、水凝胶等材料在引导轴突再生、桥接损伤腔隙中的作用。
- 疼痛研究： 研究脊髓损伤后神经病理性疼痛的发生机制（虽非此模型主要优势，但可涉及）。
结论 大鼠脊髓半横断模型是脊髓损伤基础研究领域不可或缺的工具。其单侧局限性损伤的特性为研究神经通路的特异性损伤、再生及可塑性机制提供了独特的优势。成功建立该模型的关键在于精细稳定的显微外科操作、严格的组织学验证以及周密完善的术后护理（尤其是膀胱管理）。 尽管存在局限，该模型在探索脊髓修复策略和阐明神经再生机制方面将继续发挥重要作用。研究者应充分认识模型的优缺点，并结合严谨的行为学、组织学和分子生物学等多维度评估手段，确保实验结果的可靠性和科学性。
重要提示：
- 伦理审批： 所有动物实验必须事先获得所在机构动物伦理委员会的审查和批准，严格遵守动物福利原则（3R原则）。
- 无菌操作： 手术需在严格无菌条件下进行。
- 人员培训： 实验人员需接受充分的动物手术和护理培训。
- 随机分组与盲法评估： 实验设计应包含随机分组，行为学评估应尽可能采用盲法以消除偏倚。