半数溶血值（HC50）的测定

发布时间：2026-04-16 阅读量：180 作者：生物检测中心

半数溶血值（HC50）测定技术指南

一、引言

半数溶血值（HC50）是评估血清或体液中补体系统经典激活途径总体活性的关键定量指标。它定义为在特定实验条件下，能使50%致敏绵羊红细胞发生溶血所需的补体量。补体系统作为先天性免疫防御的核心组成部分，其活性水平与多种感染、自身免疫病及炎症状态密切相关。HC50测定因其标准化与敏感性，成为临床诊断与基础免疫学研究的重要工具。

二、基本原理

测定基于补体经典激活途径的级联反应：

  1. 致敏红细胞制备： 绵羊红细胞（SRBC）作为抗原，与相应抗体（溶血素，通常为兔抗绵羊红细胞抗体）结合，形成抗原-抗体复合物。
  2. 经典途径激活： 当待测血清（含补体）加入致敏SRBC悬液时：
    • 抗原-抗体复合物激活补体C1。
    • 触发后续补体成分（C4, C2, C3, C5-C9）的级联活化。
    • 最终形成膜攻击复合物（C5b-9，亦称MAC），在致敏SRBC膜上穿孔。
  3. 溶血反应： MAC在SRBC膜上形成孔洞，导致红细胞内容物（主要是血红蛋白）外泄至溶液中，即发生溶血。
  4. 定量测定： 通过分光光度计测定上清液中释放的血红蛋白量（以吸光度表示），可精确量化溶血程度。HC50值则是通过计算能使50%红细胞溶解的血清稀释度或补体量来获得。

三、实验材料与试剂

  • 新鲜血清样本： 待测血清（如人、动物血清）。注意： 补体极不稳定，血清样本需新鲜采集分离（推荐4小时内），迅速分装后于-70°C以下冻存备用。冻融后应立即使用，避免反复冻融。实验前置于冰浴中。
  • 绵羊红细胞（SRBC）： 采集自健康绵羊，肝素或Alsever’s液抗凝，4°C保存不超过2周。使用前需洗涤并配制成适当浓度（如2%或5%悬液）。
  • 溶血素（Hemolysin）： 兔抗绵羊红细胞抗体（抗SRBC IgG抗体）。需预先滴定确定其效价（最高稀释度仍能完全溶血的浓度）。
  • 缓冲液： 常用GVB++缓冲液（Gelatin-Veronal Buffered Saline with Ca²⁺ and Mg²⁺，含明胶的巴比妥缓冲盐水，含钙镁离子），pH 7.3-7.4。钙镁离子对补体经典途径激活至关重要。也可使用含明胶或BSA的其它生理盐溶液缓冲液。
  • 稀释液： 通常使用GVB⁺⁺缓冲液（不含Ca²⁺和Mg²⁺）或生理盐水稀释血清和红细胞。
  • 阳性对照： 已知活性的标准补体血清（如混合健康人血清冻干粉复溶液）。
  • 阴性对照：
    • 溶血管： 致敏SRBC + 蒸馏水（代表100%溶血）。
    • 空白管： 未致敏SRBC + GVB⁺⁺缓冲液（代表0%溶血）。
    • 血清空白管： 待测血清最高浓度 + GVB⁺⁺缓冲液（不含红细胞，校正血清本底色）。
  • 实验器具： 试管架、精确移液器及吸头、水浴锅（37°C）、离心机、分光光度计（波长常用541nm或412nm）、冰浴装置、计时器。

四、实验步骤

  1. 致敏绵羊红细胞（EA）制备：

    • 取适量洗涤好的SRBC沉淀（如压积细胞）。
    • 加入预先滴定好的、适量浓度的溶血素溶液（通常为亚凝集效价的2倍浓度），轻轻混匀。
    • 37°C水浴孵育15-30分钟，轻柔振荡数次。
    • 孵育后，用预冷的GVB⁺⁺缓冲液（或生理盐水）洗涤细胞3-4次（离心条件：1000-1500×g, 5-10分钟，4°C），彻底去除未结合抗体。
    • 用GVB⁺⁺缓冲液重悬细胞，配制成所需浓度的致敏SRBC悬液（常用2×10^9 cells/mL）。置于冰浴备用（1-2小时内使用）。

  2. 待测血清稀释：

    • 将待测血清样本（包括阳性对照血清）置于冰浴中解冻（若冻存）。
    • 用GVB⁺⁺缓冲液对待测血清进行连续倍比稀释（例如：1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640）。通常设置6-8个梯度稀释度。每个稀释度建议做双份或三份平行管。
    • 稀释过程需在冰浴中进行，避免补体活性损失。

  3. 反应体系建立：

    • 在洁净试管中按顺序加入：
      • 血清稀释液： 各稀释度血清样品适量（常用0.5mL或1.0mL）。
      • 致敏SRBC悬液： 等体积的预冷致敏SRBC悬液（常用0.5mL或1.0mL）。
    • 关键： 加入致敏SRBC悬液后需立即轻轻混匀，启动反应。
    • 设置对照管：
      • 溶血管： 1.0mL 蒸馏水 + 1.0mL 致敏SRBC悬液。
      • 空白管： 1.0mL GVB⁺⁺缓冲液 + 1.0mL 未致敏 SRBC悬液（或致敏SRBC悬液）。
      • 血清空白管： 待测血清最高浓度管（如1:10）中的血清量 + 等体积GVB⁺⁺缓冲液（不加红细胞）。

  4. 孵育与溶血反应：

    • 将上述所有反应管（包括对照管）快速移入37°C恒温水浴锅中。
    • 准确计时孵育60分钟。期间每隔15分钟轻轻摇动反应管一次，使细胞保持悬浮状态。

  5. 终止反应与溶血测定：

    • 孵育结束后，立即将反应管转移至冰水浴中5-10分钟，终止补体反应。
    • 离心（4°C，1000-1500×g，10分钟），使未溶解的红细胞沉淀。
    • 小心吸取上清液，避免吸入沉淀细胞。

  6. 吸光度（OD）测定：

    • 将各管上清液转移至比色皿中。
    • 使用分光光度计，在541nm（血红蛋白最大吸收峰之一）或412nm波长下，以空白管（含未致敏SRBC）的上清液或GVB⁺⁺缓冲液调零，测定各管上清液的吸光度（OD值）。
    • 记录溶血管的OD值（代表100%溶血）。

  7. 数据处理与计算：

    • 计算各稀释度血清管的溶血百分率（%溶血）：
%溶血 = （样品管OD - 血清空白管OD） / （溶血管OD - 空白管OD） × 100%* `样品管OD`：待测血清管上清OD值。 * `血清空白管OD`：最高浓度血清+缓冲液管的上清OD值（校正血清本身的颜色或浊度）。 * `溶血管OD`：100%溶血对照管上清OD值。 * `空白管OD`：未致敏SRBC+缓冲液管的上清OD值（接近0）。 * 以血清稀释度（或其倒数，即血清浓度） 为横坐标（X轴，对数坐标），对应的%溶血为纵坐标（Y轴，概率单位或线性坐标），绘制溶血曲线。 * 在曲线上找到%溶血=50% 所对应的点（或通过插值法计算）。 * 读取该点对应的血清稀释度（或其倒数） ，此值即为 HC50。 * 报告方式一（常用）：HC50 = X （例如 HC50=1:160）。表示该血清1:160稀释时，在标准条件下可引起50%的致敏SRBC溶血。 * 报告方式二（单位/mL）： 有时需要将HC50换算成CH50单位/mL（Complement Hemolytic Units/mL）。通常定义为：能使50%标准致敏SRBC发生溶血的最小血清量所包含的“1单位”补体活性的倒数。例如，若1:100稀释的1mL血清含1个CH50单位，则原血清的CH50活性为100单位/mL。报告时需明确说明定义方式。

五、注意事项

  1. 补体稳定性： 补体（尤其C1、C2）极不稳定。血清采集、处理、储存（必须≤-70°C）及实验全程（除37°C孵育期外）需严格保持低温（冰浴）。避免反复冻融。
  2. 红细胞质量： SRBC应新鲜、健康，洗涤彻底，避免溶血。储存时间过长会导致自发溶血增加。致敏过程需标准化。
  3. 溶血素质量与滴定： 使用特异性强、效价高的溶血素至关重要。每次实验前或更换批次时需重新滴定溶血素效价，确保致敏效果一致。
  4. 缓冲液离子强度与pH： GVB++中的Ca²⁺、Mg²⁺及适宜的pH是经典途径激活的必要条件。缓冲液需新鲜配制或妥善保存，定期检查pH值。
  5. 温度与时间控制： 37°C孵育时间必须精确。转移试管进出水浴要迅速，减少温度波动。冰浴终止反应需及时。
  6. 混合均匀性： 加入致敏SRBC后立即轻柔混匀是保证反应均一性的关键。
  7. 离心条件： 离心速度和时间要足以沉淀未溶解细胞，但过高或过长可能导致已部分溶解的脆弱细胞进一步破裂，影响结果。
  8. 背景干扰： 高脂血症、黄疸、溶血样本本身会影响OD值读数，必须设置血清空白管进行校正。
  9. 稀释范围： 应确保设置的血清稀释度范围能涵盖0%到100%溶血的区间，特别是50%溶血点落在曲线中部线性较好的区域（通常20%-80%）。
  10. 标准化： 不同实验室间结果的比较需基于严格一致的实验条件（红细胞浓度、溶血素用量、反应体积、孵育时间、缓冲液配方等）。阳性对照（标准血清）的使用至关重要。

六、应用与意义

HC50测定广泛应用于：

  • 临床诊断：
    • 评估补体系统功能状态：先天性补体缺陷病（如C1q, C4, C2, C3等缺乏）、获得性低补体血症（如SLE活动期、感染性心内膜炎、冷球蛋白血症、膜增生性肾小球肾炎、肝病等）。
    • 监测疾病活动度及治疗反应（如SLE）。
  • 免疫学研究： 评估药物、毒素、生物材料等对补体活性的影响；研究补体在疾病发生发展中的作用机制。
  • 质量控制： 在涉及补体活性的生物制品（如疫苗、免疫调节剂）研发和生产中，评估其补体激活潜力或对补体活性的影响。

七、总结

半数溶血值（HC50/CH50）测定是评估补体经典途径整体功能活性最经典、应用最广泛的方法。其成功的关键在于实验操作的标准化、对细节（尤其是温度、时间、试剂质量和稳定性）的严格控制以及对背景干扰的校正。通过精确测定能溶解50%标准致敏红细胞的血清量或稀释度，HC50为临床医生和研究人员提供了评估补体系统功能状态不可或缺的量化指标，在免疫相关疾病的诊断、机制研究和治疗监测中具有重要价值。

底部图片-PC版 底部图片-移动版