绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH（足跖增厚法）

绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠迟发型超敏反应（DTH）实验方案（足跖增厚法）

摘要： 本实验方案详细描述了使用绵羊红细胞（SRBC）作为抗原，通过足跖增厚法在小鼠体内诱导和检测迟发型超敏反应（DTH）的标准操作流程。DTH反应是评估体内细胞介导免疫（CMI）功能的重要模型，涉及抗原特异性T细胞（主要是Th1细胞）的活化、细胞因子释放及单核/巨噬细胞浸润。

关键词： 迟发型超敏反应；DTH；绵羊红细胞；SRBC；细胞免疫；T细胞；足跖增厚法；小鼠模型

1. 引言 迟发型超敏反应（DTH）是由抗原特异性T淋巴细胞介导的炎症反应，通常在再次接触抗原后24-72小时达到高峰。其特征为大量单核细胞和淋巴细胞在抗原局部浸润、聚集，导致组织肿胀和硬结。SRBC因其良好的免疫原性且易于获取，是诱导小鼠DTH反应的经典抗原。足跖增厚法通过精确测量攻击侧与对照侧足跖厚度差值，量化DTH反应强度，是评价免疫调节药物、研究免疫缺陷或过强疾病机制（如自身免疫病、移植排斥）的有效工具。

2. 实验材料

实验动物： 健康成年小鼠（品系如BALB/c，C57BL/6等，通常6-8周龄），雌雄各半或根据研究需求统一性别。饲养于标准无特定病原体（SPF）环境，自由摄食饮水。实验前适应性饲养至少3天。
抗原：
- 致敏抗原： 无菌Alsever液保存的绵羊红细胞（SRBC），使用前用无菌生理盐水洗涤3次（1500 rpm，离心5分钟），最后配制成所需浓度的细胞悬液（如1-2×10^9个细胞/mL）。
- 攻击抗原： 同批次的SRBC，洗涤方法同上，通常配制成较低浓度（如2×10^8个细胞/mL）。浓度需预实验优化。
试剂：
- 无菌生理盐水（0.9% NaCl）
- 无菌Alsever液（可选，用于SRBC保存）
- 麻醉剂（如吸入性异氟烷）
- 足跖厚度测量相关消毒剂（如75%乙醇）
主要仪器设备：
- 精密千分尺（精度0.01 mm）或专用鼠足厚度测量仪
- 微量注射器（50 μL或100 μL）及配套针头（26-30G）
- 离心机
- 生物安全柜或超净工作台
- 动物固定器（可选）
- 计时器
其它： 记号笔、电子秤、记录表格。

3. 实验方法 3.1 实验设计与分组

设立实验组（接受致敏和攻击）和必要的对照组：
- 阴性对照组： 致敏时注射生理盐水，攻击时注射SRBC悬液。用于排除SRBC攻击本身引起的非特异性炎症。
- 阳性对照组（可选）： 使用已知能诱导强DTH反应的抗原或免疫增强剂处理的动物。
- 模型对照组： 仅接受SRBC致敏和攻击的标准处理动物。
- 药物/处理组： 在致敏前后给予待测物质处理的动物。
各组动物数量通常为6-10只，以保障统计效力。随机分组。

3.2 致敏（Sensitization）

准备致敏用SRBC悬液（如1×10^9个细胞/mL，用无菌生理盐水配制）。
轻轻混匀SRBC悬液，避免细胞破裂。
在小鼠背部或腹部选择2-4个点，皮下（SC）注射致敏抗原。常用方案： 每只小鼠注射100 μL SRBC悬液（相当于1×10^8个细胞）。亦可多点注射（如4点，每点25 μL）。记录注射日期和时间。
阴性对照组小鼠在相同部位注射等体积无菌生理盐水。

3.3 攻击（Challenge/ Elicitation）

通常在致敏后第4天或第5天进行。（最佳时间点需预实验确定，一般为4-7天）。

准备攻击用SRBC悬液（如2×10^8个细胞/mL，用无菌生理盐水配制）。
致敏结束，攻击前，测量并记录所有小鼠右后足跖（或左后足跖，需统一）的基线厚度（T0）。测量方法见3.4。
轻轻混匀攻击抗原悬液。
将小鼠用温和吸入麻醉（如异氟烷）进行短暂麻醉。
用微量注射器抽取20-30 μL攻击抗原悬液。
在已测量基线厚度的同一只后足（如右后足）的足垫皮下（SC）注射攻击抗原（如20 μL，相当于4×10^6个细胞）。 注射时缓慢推注，避免渗漏。
阴性对照组小鼠在同侧足垫注射等体积无菌生理盐水（重要： 需确认该组是否也致敏过生理盐水）。
记录攻击日期和时间。

3.4 足跖厚度测量（Footpad Thickness Measurement）

攻击前（T0）： 在攻击操作前即刻测量。使用精密千分尺。操作者需经过训练以保证测量位置、力度的一致性。轻提小鼠被测后足，用千分尺测量足垫最厚处（通常在跖骨区域），避免夹入脚趾。记录读数（精确至0.01 mm）。每只足至少测量3次，取平均值作为该时间点的厚度值。
攻击后测量时间点： 通常在攻击后24小时和48小时进行测量（T24h， T48h）。选择反应高峰期（常为24h）测量是关键。
测量方法： 同上。务必保证每次测量位置、手法一致。测量时可采用温和手动保定或短暂麻醉（尤其对挣扎小鼠）。
记录： 清晰记录每只小鼠编号、组别及各时间点的足跖厚度测量值。

3.5 数据计算与统计

计算足跖肿胀度（ΔT）： 对于每只小鼠每个测量时间点： ΔT (mm) = T_post-challenge (T24h或T48h) - T0
- 此肿胀度包含注射抗原引起的机械性肿胀和DTH特异性炎症肿胀。
计算DTH特异性反应值： 为排除注射本身造成的非特异性肿胀，常用以下两种方式之一：
- 方式A： DTH特异性反应 (mm) = ΔT_实验组 (攻击SRBC) - ΔT_阴性对照组 (攻击生理盐水)
  - 解释： 将实验组（致敏并攻击SRBC）的肿胀度减去阴性对照组（致敏生理盐水或未致敏 + 攻击SRBC）的肿胀度。此方法最常用，直接扣除了非特异性背景肿胀。
- 方式B： 若实验组自身设有未攻击侧足作为对照（较少用，因动物间差异大），则：DTH特异性反应 (mm) = ΔT_攻击侧 - ΔT_未攻击侧
统计分析： 数据以均值±标准差表示。使用合适的统计软件进行分析：
- 组间比较：通常采用单因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齐性且满足正态分布，事后检验用Tukey法或多重比较；若不满足，可采用非参数检验（Kruskal-Wallis test）。
- 攻击前后自身比较：可采用配对t检验（Paired t-test）。
- P < 0.05 被认为差异具有统计学意义。

4. 注意事项与优化

抗原浓度与体积： SRBC浓度（致敏和攻击）、注射体积需严格优化（预实验）。浓度过低反应弱，过高可能诱导耐受或过强反应影响动物福利。攻击体积通常为20-30 μL（足垫）。
时间点： 致敏到攻击的间隔（4-7天），以及攻击后测量时间（24h， 48h）是成功关键，需根据小鼠品系、抗原批号和实验目的通过预实验确定。
动物品系： 不同品系小鼠对SRBC的DTH反应性存在差异（如C57BL/6反应通常弱于BALB/c）。选择合适品系。
注射技巧： 足垫皮下注射需熟练操作，确保准确注入皮下而非皮内或肌肉层，避免抗原渗漏。渗漏会显著影响结果。
测量一致性： 足跖厚度测量是核心量化指标。必须由同一操作者、使用同一仪器、在固定位置、以相同力度测量。操作者需严格培训。
麻醉： 如需麻醉，选择起效快、恢复快、对免疫影响小的麻醉剂（如异氟烷），麻醉时间和深度需一致。
动物福利： DTH反应导致足跖肿胀疼痛。实验设计应遵循3R原则。攻击后48小时通常是观察终点，若肿胀严重或动物明显痛苦（如跛行、不饮不食），应提前人道终点。必要时可在攻击后给予镇痛剂（需评估是否影响免疫反应）。
环境因素： 维持动物房温度、湿度、光照周期的稳定，减少环境应激对免疫反应的影响。
SRBC批次： 不同批次SRBC免疫原性可能有差异，尽量使用同一批次抗原完成一个完整实验。使用前检查SRBC活力（如台盼蓝拒染率>95%）。
个体差异： 设定合理的样本量以抵消个体差异。反应过弱（如ΔT < 0.1 mm）的个体可考虑剔除并补充样本（需在方案中预先规定标准）。
组织学验证（可选）： 可在测量终点后取足跖组织进行固定、切片、H&E染色，镜下观察单核细胞浸润情况，作为DTH反应的形态学确认。