二硝基氟苯诱导小鼠DTH（耳肿胀法）

发布时间：2025-06-23 16:35:44 阅读量：1 作者：生物检测中心

二硝基氟苯诱导小鼠迟发型超敏反应模型（耳肿胀法）

摘要： 迟发型超敏反应（Delayed-Type Hypersensitivity, DTH）是T细胞介导的细胞免疫应答的重要表现形式。二硝基氟苯（Dinitrofluorobenzene, DNFB）诱导的小鼠耳肿胀模型是研究DTH反应、免疫调节机制以及筛选免疫调节药物的经典体内实验方法。本方案详细描述了利用DNFB在小鼠体内建立DTH模型并通过耳肿胀程度评估反应强度的标准操作流程。

一、引言 迟发型超敏反应（DTH）主要由抗原特异性CD4+ Th1和CD8+ T细胞活化、增殖并释放细胞因子（如IFN-γ, TNF-α），招募并活化巨噬细胞等炎症细胞至局部组织，导致以单核细胞浸润为特征的炎症反应。DNFB是一种强效的化学半抗原（Hapten），当其涂抹于皮肤时，可与皮肤蛋白共价结合形成完全抗原，诱发机体产生特异性的T细胞免疫应答。在致敏期初次接触后，再次于局部（如耳部）激发，即可在该部位引发典型的DTH炎症反应，表现为明显的局部组织肿胀、炎性细胞浸润。通过精确测量激发前后小鼠耳部厚度的变化（耳肿胀度），可定量评估DTH反应的强度。该模型操作相对简便、重复性好，被广泛应用于免疫学基础研究及药物免疫调节活性的评价。

二、材料

  1. 实验动物： 健康成年小鼠（品系如C57BL/6、BALB/c等，6-8周龄，体重18-22g）。雌雄各半或根据实验要求统一性别。实验前于SPF级动物房适应性饲养至少3天。（注：所有动物实验需获得相关伦理委员会批准并遵循动物福利原则）
  2. 试剂：
    • 二硝基氟苯（DNFB）
    • 丙酮（Acetone）
    • 橄榄油（Olive oil）
    • 70%乙醇
    • 麻醉剂（如异氟烷，可选，用于测量耳厚时减少小鼠挣扎）
  3. 仪器与耗材：
    • 精密电子天平
    • 微量移液器（20-200μl）及无菌吸头
    • 动物剃毛器或脱毛膏（用于腹部脱毛）
    • 精密游标卡尺（精度0.01mm）或专用耳厚测量仪
    • 小鼠固定器
    • 计时器
    • 防护用品（手套、口罩、护目镜、实验服）（注：DNFB有刺激性和致敏性，操作需在通风橱内进行并严格防护）
    • 离心管（用于配制溶液）
    • 涂抹用棉签或移液器

三、实验方法

  1. 溶液配制（通风橱内操作，佩戴防护装备）：

    • 致敏溶液配制（Day 0）： 称取适量DNFB，用丙酮:橄榄油（1:1, v/v）混合溶剂溶解，配制0.5% (w/v) DNFB溶液（例如：5mg DNFB溶于1ml混合溶剂）。现用现配或避光密封保存于4°C（24小时内使用）。
    • 激发溶液配制（Day 5）： 同法配制0.2% (w/v) DNFB溶液（例如：2mg DNFB溶于1ml混合溶剂）。
    • 溶剂对照（Vehicle）： 丙酮:橄榄油（1:1, v/v）混合溶剂。

  2. 致敏阶段（Sensitization, Day 0）：

    • 轻柔固定小鼠。
    • 使用剃毛器或脱毛膏小心去除小鼠腹部毛发（约2cm x 2cm区域），暴露皮肤。避免损伤皮肤。
    • 待皮肤完全干燥后（如有残留脱毛膏需用温水洗净擦干），用移液器或棉签取50μl 0.5% DNFB溶液（或溶剂对照），均匀涂抹于已脱毛的腹部皮肤表面。确保溶液覆盖预定区域。
    • 将小鼠放回笼中，正常饲养。

  3. 激发阶段（Challenge, Day 5）：

    • 致敏5天后，轻柔固定小鼠。
    • 测量基线耳厚： 使用精密游标卡尺或耳厚测量仪，在小鼠左耳（或右耳，需统一）中部同一位置（避开主要血管），小心测量耳廓厚度。可轻微麻醉小鼠（如吸入少量异氟烷）以减少挣扎造成的测量误差。重复测量3次，取平均值作为激发前耳厚（H0）。记录数据。
    • 激发： 立即用移液器或棉签取10μl 0.2% DNFB溶液（对于致敏组），小心均匀涂抹于小鼠单侧耳廓的两面（正面和反面）。对于溶剂对照组小鼠，则涂抹10μl溶剂对照（丙酮:橄榄油）于耳廓两面。（关键：确保激发仅作用于预定耳部）
    • 将小鼠放回笼中，正常饲养。

  4. 耳肿胀度测量（Day 6/7 - 激发后24/48小时）：

    • 激发后24小时（或根据实验设计，常用24或48小时），再次轻柔固定小鼠（可轻微麻醉）。
    • 使用与激发前相同的测量仪器和方法，在相同位置测量被激发耳部的厚度（H24或H48）。重复测量3次，取平均值。
    • 计算耳肿胀度： 耳肿胀度（ΔH, mm） = 激发后耳厚平均值（H24或H48） - 激发前耳厚平均值（H0）
    • 计算耳肿胀抑制率（如评价药物作用）： 耳肿胀抑制率（%） = [(溶剂对照组平均ΔH - 给药组平均ΔH) / 溶剂对照组平均ΔH] × 100%

  5. （可选）组织学分析：

    • 测量耳肿胀度后，可颈椎脱臼法处死小鼠。
    • 迅速剪下激发耳和未激发对照耳（如对侧耳），置于4%多聚甲醛中固定。
    • 常规石蜡包埋、切片，进行HE染色，观察炎性细胞（单核/巨噬细胞、淋巴细胞等）浸润程度，评估组织病理学变化。

四、注意事项

  1. 安全防护： DNFB具有高度皮肤致敏性、刺激性和潜在毒性。所有涉及DNFB称量、溶解、涂抹的操作必须在通风良好的化学通风橱内进行。实验人员必须穿戴一次性手套（推荐双层）、实验服、口罩和护目镜，避免皮肤直接接触或吸入蒸气。接触过DNFB的耗材按危险废弃物处理。
  2. 动物伦理： 实验方案必须经过机构动物伦理委员会审批。操作过程应尽可能轻柔，减少动物痛苦。密切观察动物状态（如活动、摄食、饮水），出现严重不良反应（如过度消瘦、严重皮炎）应及时人道处理。
  3. 环境控制： 保持动物房温度（22±2℃）、湿度（50±10%）和光照周期（12小时明/暗循环）稳定，提供充足食物和水。
  4. 一致性：
    • 小鼠品系与状态： 不同品系小鼠对DNFB的敏感性可能不同，需保持一致。确保小鼠健康，实验期间避免使用可能影响免疫状态的药物或操作。
    • 操作者： 最好由同一实验人员完成致敏、激发和耳厚测量，以减小操作误差。
    • 涂抹部位与剂量： 腹部脱毛区域和耳部激发区域需精确、一致。涂抹剂量（体积）务必准确。
    • 测量： 测量耳厚时，位置、力度、仪器需保持一致。游标卡尺测量时，夹持力度以刚好接触耳廓无压迫变形为度。轻微麻醉可显著提高测量准确性和重复性。
  5. 溶剂对照： 必须设置溶剂对照组（仅涂抹丙酮:橄榄油），以排除溶剂本身可能引起的非特异性炎症反应。
  6. 激发时机： 通常在致敏后5天进行激发，此时T细胞应答达到高峰。激发后24小时是测量耳肿胀的常用时间点（反应峰值附近），也可根据实验目的选择48小时或其他时间点。
  7. 数据记录与分析： 详细记录每只小鼠的耳厚原始数据、分组信息、操作日期等。数据通常以Mean ± SEM表示，组间比较采用适当的统计学方法（如t检验、方差分析ANOVA）。

五、结果解读

  • 成功模型表现：
    • 溶剂对照组： 耳肿胀度（ΔH）应非常轻微（接近0），表明溶剂本身基本不引起炎症。
    • DNFB致敏+激发组： 耳肿胀度（ΔH）显著高于溶剂对照组（通常有统计学意义p<0.05或更低），表明成功诱导了DTH反应。
    • （可选）组织学： DNFB激发耳组织HE染色可见大量单核细胞、淋巴细胞浸润，表皮可能增厚甚至坏死，真皮层血管扩张充血水肿。未激发耳或溶剂对照耳无明显病变。
  • 实验失败可能原因：
    • DNFB溶液配制错误（浓度不准、失效）。
    • 致敏或激发操作不当（涂抹区域不准确、剂量不足、皮肤屏障未有效穿透）。
    • 小鼠免疫状态异常（品系不敏感、应激、感染等）。
    • 测量误差大（位置不一致、力度不一、小鼠挣扎）。
    • 激发与测量间隔时间不当。

六、应用 该模型主要用于：

  1. 基础免疫学研究： 阐明DTH反应的发生机制、细胞与分子调控网络（如T细胞亚群、细胞因子、趋化因子的作用）。
  2. 免疫调节药物评价：
    • 免疫抑制剂筛选与评价： 如研究糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂（如环孢素A）、新型免疫抑制剂对DTH反应的抑制效果。
    • 免疫增强剂评价： 在特定条件下（如免疫低下模型），评估药物能否增强DTH反应。
  3. 接触性皮炎研究： 模拟由化学物质引起的过敏性接触性皮炎（ACD）的免疫病理过程。
  4. 中药/天然产物免疫活性研究： 评价其调节细胞免疫的能力。

结论 二硝基氟苯（DNFB）诱导的小鼠耳肿胀DTH模型是研究T细胞介导的迟发型超敏反应的标准且可靠的方法。通过精确控制致敏和激发条件，规范操作（尤其注意安全防护和测量准确性），该模型能稳定、定量地反映细胞免疫应答的强度，为免疫学基础研究及免疫调节药物的研发提供重要的体内实验依据。