大鼠、兔酵母/内毒素致热模型

大鼠及兔酵母聚糖/内毒素致热模型研究

摘要： 酵母聚糖(Zymosan)与细菌内毒素(LPS)是诱导实验动物发热反应的经典致热原。本模型广泛应用于发热机制、解热药物筛选及体温调节研究。本文详细阐述了大鼠及兔两种动物模型中酵母聚糖和内毒素致热的实验方法、机制特点及应用价值。

一、 模型原理

1. 致热原作用：

   • 酵母聚糖： 来源于酵母细胞壁的葡聚糖-甘露聚糖复合物，被巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞表面的模式识别受体识别（如TLR-2, Dectin-1），激活细胞内信号通路（如NF-κB），促使促炎细胞因子（如IL-1β, IL-6, TNF-α）合成与释放。这些细胞因子作为内源性致热原作用于下丘脑体温调节中枢，引发发热。
   • 内毒素(LPS)： 革兰氏阴性菌外膜主要成分，通过结合巨噬细胞、单核细胞等表面的CD14/TLR-4/MD2受体复合物，强烈激活NF-κB等信号通路，导致大量促炎细胞因子（IL-1β, IL-6, TNF-α）释放，最终作用于下丘脑引起发热。

2. 发热特点：

   • 潜伏期： LPS模型的潜伏期通常较短（30-90分钟），酵母聚糖模型潜伏期稍长（1-3小时）。
   • 热型： 多为单相热，体温升高幅度及持续时间与致热原剂量、动物种属及个体状态密切相关。
   • 机制关联： 两者均通过激活免疫细胞→释放细胞因子→作用于下丘脑的共同通路引起发热，是研究发热病理生理及药物作用的理想工具。

二、 动物选择

1. 大鼠(常用SD或Wistar品系)：

   • 优势： 成本较低，操作相对简便，实验所需空间小，适合大样本量筛选研究（如药物初筛）。对酵母聚糖和LPS均有良好发热反应。
   • 劣势： 体型较小，连续多次采血受限；体温波动相对较大（如受应激、昼夜节律影响较明显）；下丘脑体积小，特定中枢机制研究操作难度略高。
   • 常用体重： 180-250g。

2. 兔(常用新西兰白兔)：

   • 优势： 体型较大，便于实验操作（如耳缘静脉注射、多次采血、安放心血管参数监测设备等）；体温相对稳定，基线波动小；发热反应稳定且重现性好，尤其适用于需要精确、持续测温或药物作用机制深入研究。
   • 劣势： 成本较高，饲养空间需求大，单次实验动物用量相对较少。
   • 常用体重： 2.0-3.0kg。

三、 材料与方法

1. 主要试剂与仪器：

   • 致热原：
     • 酵母聚糖(Zymosan A)：无菌生理盐水配制成所需浓度混悬液（常用浓度范围：大鼠5-20 mg/kg体重；兔10-40 mg/kg体重）。
     • 细菌内毒素(LPS, 如大肠杆菌O55:B5或O111:B4)：无菌生理盐水溶解（常用浓度范围：大鼠10-100 μg/kg体重；兔0.5-5 μg/kg体重）。
   • 溶剂对照： 无菌生理盐水。
   • 测温设备： 高精度电子体温计（配细软肛温探头）、红外耳温枪（兔耳测温）、或植入式无线体温遥测系统（用于连续、无应激监测）。
   • 其他： 注射器、针头、酒精棉球、动物固定装置、计时器等。

2. 实验前准备：

   • 动物适应性饲养： 实验动物于标准SPF或清洁级环境中适应性饲养至少3-7天，自由饮水摄食，维持12/12小时明暗循环。
   • 环境控制： 实验在恒温（推荐22-25°C）、恒湿（50-60%）、安静、避免强风的环境进行。温度稳定性对发热反应评估至关重要。
   • 基线体温测定： 正式实验前至少连续测定2-3天的基线体温（每日固定时间点，如上午9-11点）。测定方法应与正式实验一致（通常大鼠用肛温法，兔可用肛温法或耳温法）。选择体温稳定、健康的动物入组。

3. 致热模型建立：

   • 分组： 将动物随机分为模型组（注射致热原）和对照组（注射等体积生理盐水）。必要时可设置不同剂量组或多个时间点观察组。
   • 给药途径：
     • 大鼠： 酵母聚糖或LPS通常采用腹腔注射或尾静脉注射。腹腔注射操作简便；尾静脉注射起效更快，但操作难度略高。
     • 兔： 酵母聚糖或LPS通常采用耳缘静脉注射。
   • 测温：
     • 大鼠： 主要采用肛温法。轻柔保定动物，将润滑过的电子体温计探头轻轻插入直肠约2-3cm，待读数稳定（约30秒）后记录。操作需快速轻柔以减轻应激导致的体温变化。
     • 兔： 可采用肛温法（插入深度约4-5cm）或红外耳温枪对准耳道测量（需确保探头清洁并定位准确）。耳温法应激更小但需注意个体差异和环境温度校准。
   • 测温频率： 注射前测量一次作为T0（基础值）。注射后根据研究目的设定测温时间点。典型方案：
     • 注射后每间隔30分钟至1小时测量一次，持续3-6小时（观察升温峰值和热型）。
     • 或在关键时间点（如预计发热高峰时段）加密测量。
   • 数据记录： 详细记录每只动物在每个时间点的体温值。

4. 附加指标（可选）：

   • 血液采集： 在特定时间点（如发热高峰）采集血液，分离血清或血浆，用于检测细胞因子（IL-1β, IL-6, TNF-α）水平（常用ELISA法），关联发热程度与炎症反应强度。
   • 行为学观察： 记录动物蜷缩、竖毛、活动减少等“病态行为”。

四、 模型评估指标

1. 核心指标：

   • 体温变化值(ΔT)： 各时间点体温(Tt)与基础体温(T0)的差值。
   • 发热峰值(Peak ΔT)： 发热期间达到的最高ΔT值。
   • 发热潜伏期(Latency)： 从注射致热原到ΔT升高超过0.5°C所需的时间。
   • 发热反应指数(Fever Index, FI)： 以时间为横轴（X轴），ΔT为纵轴（Y轴）绘制发热曲线，计算曲线下面积（AUC，通常从注射后到体温基本恢复或特定研究终点）。FI综合反映了发热的高度和持续时间。

2. 次级指标：

   • 血清/血浆中促炎细胞因子（IL-1β, IL-6, TNF-α）水平。
   • 动物行为学改变。

五、 模型特点与优缺点

1. 酵母聚糖模型：
   • 优点： 模拟真菌感染相关的发热；激活TLR2/Dectin-1通路，与经典的LPS/TLR4通路形成有益补充；发热反应持续时间相对较长。
   • 缺点： 为混悬液，注射剂量的精确性略低于溶液；发热反应强度可能略逊于LPS。
2. 内毒素(LPS)模型：
   • 优点： 是细菌感染相关发热的“金标准”模型；作用迅速、发热强度高、剂量反应关系明确、重现性极佳；研究资料最丰富。
   • 缺点： 价格相对较高；高剂量可能导致休克等严重反应（需严格控制剂量）；主要模拟革兰氏阴性菌感染。
3. 大鼠模型： 成本低、通量高，适于筛选研究。但体温稳定性相对较差，采血量有限。
4. 兔模型： 体温稳定、操作便利（耳缘静脉）、便于采血和监测，实验结果更精确可靠。但成本高、通量较低。

六、 模型应用

1. 解热药物筛选与评价： 评估候选药物（如NSAIDs、天然产物、中药复方等）对不同致热原诱导发热的抑制效果（降低峰值、缩短发热持续时间）。
2. 发热机制研究： 探究细胞因子（IL-1β, IL-6, TNF-α）、前列腺素（PGE2）、神经递质、下丘脑内信号通路（如NF-κB, MAPK, JAK-STAT）在发热发生发展中的作用。
3. 体温调节中枢研究： 结合脑部微量注射、损毁、电生理等技术，研究下丘脑视前区等关键核团在发热反应中的作用。
4. 感染性疾病的病理生理研究： 作为炎症反应研究的组成部分。

七、 注意事项

1. 动物福利： 严格遵守动物实验伦理规范，减少动物痛苦。发热本身是其应激反应，注意观察动物状态，避免使用过高剂量导致动物极度不适或死亡（尤其LPS模型）。
2. 标准化操作：
   • 环境温度： 恒定且适宜（22-25°C）是关键，环境温度过高或过低会显著影响动物的体温调节能力及发热反应。
   • 操作手法： 体温测量、动物保定、注射操作务必轻柔、熟练、快速，最大程度减少操作应激对体温的干扰。建议固定操作人员。
   • 时间一致性： 实验操作（注射、测温）尽量在一天中相近时间段进行，以减少昼夜节律影响。
   • 致热原配置与保存： 严格无菌操作。LPS溶液应避免反复冻融。酵母聚糖混悬液需充分混匀后使用。
3. 个体差异： 动物对致热原的反应存在个体差异，需保证足够样本量（通常每组不少于6-8只）。
4. 剂量选择： 致热原的最佳剂量需通过预实验确定，以达到足够且可重复的发热幅度（ΔT峰值通常1.5-2.5°C为宜），同时避免动物出现严重毒性反应（尤其LPS）。不同来源、批次、纯度的致热原活性可能有差异。
5. 对照组设置： 必须设置注射等体积生理盐水的对照组，以排除注射操作和溶剂本身对体温的可能影响。

结论：

大鼠及兔酵母聚糖/内毒素致热模型是研究发热病理生理机制和评价解热药物药效的成熟、可靠工具。大鼠模型具有高通量、低成本的优势，适用于药物筛选；兔模型则因其体温稳定、易于操作和采样，更适合机制研究和精确评价。研究人员可根据具体实验目的、资源条件和研究深度选择合适的动物模型（大鼠或兔）和致热原类型（酵母聚糖或LPS）。严格遵守标准化操作流程和动物伦理规范是获得可靠、可重复结果的根本保障。

参考文献： (此处省略具体文献列表，实际写作中应引用相关经典文献和最新研究进展)