大鼠|型糖尿病大鼠皮肤溃疡模型

大鼠 I 型糖尿病皮肤溃疡模型构建与应用

摘要： 糖尿病皮肤溃疡是糖尿病严重的慢性并发症之一，具有难愈合、易复发、高致残率的特点。建立稳定可靠的动物模型是深入研究其发病机制及评价新疗法的关键。本文详细阐述了大鼠 I 型糖尿病皮肤溃疡模型的构建方法、模型评价要点及其在医学研究中的应用价值。

一、引言

糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）在全球范围内发病率持续攀升，由其引发的慢性并发症严重威胁患者健康与生存质量。糖尿病皮肤溃疡（Diabetic Skin Ulcers），特别是糖尿病足溃疡（Diabetic Foot Ulcers, DFU），是导致患者截肢的主要原因。I 型糖尿病（T1DM）由于胰岛素绝对缺乏，其代谢紊乱状态对皮肤组织损伤和修复的影响尤为显著。利用大鼠建立 I 型糖尿病皮肤溃疡模型，能够模拟人类疾病的关键病理生理特征，为研究溃疡形成机制、测试新型药物与治疗策略提供重要的实验平台。

二、模型构建方法

构建该模型主要分两大步骤：首先诱导大鼠稳定的 I 型糖尿病状态，然后在糖尿病大鼠体表创建标准化的皮肤溃疡创面。

1. I 型糖尿病大鼠模型的建立 (链脲佐菌素诱导法)

   • 实验动物： 通常选用健康成年雄性 Sprague-Dawley (SD) 或 Wistar 大鼠（6-8周龄），体重约180-220克。雄性大鼠可避免雌性激素周期对实验结果的影响。饲养于标准环境（温度22±2℃，湿度50±10%，12小时昼夜循环），自由摄食饮水，适应性饲养一周。
   • 主要试剂： 链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）。STZ 对胰岛β细胞具有选择性毒性，可诱导胰岛素缺乏。
   • 操作流程：
     1. STZ 溶液配制： 在冰浴条件下，用预冷的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 M, pH 4.5）或生理盐水（部分文献使用）新鲜配制 STZ 溶液。浓度通常为1-2%（即10-20 mg/mL），需避光并尽快使用（15-30分钟内）。
     2. 给药： 大鼠禁食（不禁水）6-12小时后，按 50-65 mg/kg 体重 的单次剂量腹腔注射 STZ 溶液。此剂量范围是诱导稳定 T1DM 的常用剂量。注射体积控制在1-2 mL/kg左右。
     3. 诱导期管理： 注射后给予大鼠含5-10%蔗糖的饮水24-48小时，预防STZ导致的早期严重低血糖。之后恢复常规饮水。
     4. 糖尿病状态确认： 注射后 72小时 起，连续监测尾静脉血糖（使用血糖仪）。通常以 空腹血糖 ≥ 16.7 mmol/L (300 mg/dL) 且维持稳定至少一周作为成功诱导 T1DM 的标准。成功诱导率通常在60-90%之间，未达标大鼠应排除。
     5. 糖尿病维持期： 糖尿病大鼠需维持高血糖状态至少 1-2周（甚至更长时间，如4周），使其体内代谢紊乱（如高血糖、胰岛素缺乏、血脂异常）相对稳定，并可能开始出现早期神经血管并发症，然后再进行皮肤溃疡造模。此期间需密切观察大鼠状态（多饮、多尿、体重增长缓慢或下降），定期监测血糖。

2. 皮肤溃疡模型的建立 (缺血再灌注损伤法 - 磁铁压迫法为例)

   • 理论基础： 模拟糖尿病下肢缺血再灌注损伤，这是糖尿病足溃疡发生的重要机制之一。
   • 材料： 两块直径相近（如12mm）、表面光滑的圆形磁铁（异极相对产生强大吸力）。
   • 操作流程：
     1. 术前准备： 在糖尿病状态稳定后（通常 STZ 注射后1-4周），选择进行溃疡造模。大鼠麻醉（常用腹腔注射水合氯醛或异氟烷吸入麻醉），背部剃毛并脱毛剂去除残毛，清洁皮肤。
     2. 皮肤缺血诱导：
        • 将两块磁铁分别置于大鼠背部两侧剃毛区域（避开脊柱中线），利用磁力相互吸引，持续压迫夹在中间的皮肤组织。磁铁大小和吸力决定了缺血区域。
        • 关键参数 - 缺血时间： 通常设置为 2-3小时。此期间磁铁压迫导致受压皮肤区域完全缺血。
     3. 再灌注损伤诱导：
        • 到达预定缺血时间后，小心移除磁铁。移除磁铁瞬间，血流恢复进入受压区域，启动再灌注损伤过程。
     4. 创面形成：
        • 移除磁铁后，受压的圆形区域皮肤因缺血再灌注损伤，通常在 24-72小时内 会出现明显的组织坏死、起泡、脱落，最终形成一个边界清晰、全层皮肤缺损的圆形溃疡创面。创面大小与磁铁直径一致。
     5. 术后护理： 将大鼠单笼饲养，防止互相舔咬创面。创面一般暴露处理，不覆盖敷料（除非特定实验设计需要）。定期观察创面情况（大小、深度、渗出、感染迹象）、大鼠活动及体重。

三、模型评价要点

1. 糖尿病状态评估：
   • 血糖水平： 持续监测空腹血糖，确保持续高于16.7 mmol/L。
   • 体重变化： 糖尿病大鼠体重增长缓慢或下降，与对照组（非糖尿病假手术组）差异显著。
   • 血清胰岛素： （可选）可检测血清胰岛素水平，T1DM大鼠显著低于正常。
2. 皮肤溃疡创面评估：
   • 创面大体观察： 记录创面形成时间、颜色、渗出物、坏死组织、肉芽组织生长、上皮爬行、感染迹象等。
   • 创面面积测量： 定期（如术后第1、3、7、10、14天等）使用数码相机在固定距离和条件下拍摄创面照片。利用图像分析软件（如ImageJ）计算创面面积。计算创面愈合率：愈合率(%) = [(初始创面面积 - 第X天创面面积) / 初始创面面积] × 100%。糖尿病溃疡组的愈合速率显著慢于非糖尿病溃疡组。
   • 组织病理学检查： 在造模后不同时间点（如第3、7、14天）或研究终点处死大鼠，切取包含溃疡中心及边缘的组织块。固定、包埋、切片后进行：
     • 苏木素-伊红（H&E）染色： 观察组织全层结构破坏、坏死范围、炎症细胞浸润（中性粒细胞、巨噬细胞等）、肉芽组织形成（成纤维细胞、新生血管）、上皮再生情况。
     • 特殊染色：
       • Masson三色染色： 评估胶原纤维的沉积、排列和成熟度（反映组织修复质量）。
       • CD31/PECAM-1 免疫组化： 标记血管内皮细胞，定量分析创面组织内的微血管密度（反映血管新生能力，糖尿病组常受损）。
     • 组织学评分： 可对炎症程度、肉芽组织厚度、胶原沉积、再上皮化程度等进行半定量评分，比较组间差异。
   • 分子生物学检测： （可选）取创面组织，检测与炎症（如TNF-α, IL-1β, IL-6）、血管新生（如VEGF, Angiopoietins）、细胞外基质重塑（如TGF-β, MMPs, TIMPs）、氧化应激（如MDA, SOD）等相关基因或蛋白的表达水平，探讨分子机制。

四、模型特点与优势

1. 病理生理相关性高： 成功模拟了I型糖尿病核心特征（胰岛素绝对缺乏、持续高血糖）及糖尿病皮肤溃疡的关键病理过程（缺血再灌注损伤、炎症反应亢进、血管新生障碍、胶原代谢紊乱、上皮化延迟）。
2. 创面标准化： 磁铁压迫法产生的溃疡创面大小、深度（全层）相对均一，位置对称（背部），有利于组间比较和定量分析。
3. 操作相对简便： STZ诱导和磁铁压迫造模技术成熟，易于在常规实验室开展。
4. 评价指标明确： 创面愈合率、组织病理学改变等评价指标清晰可靠。
5. 应用广泛： 是研究糖尿病溃疡发病机制、筛选和评价促进愈合药物（生长因子、干细胞、药物缓释系统、生物材料敷料等）、新型物理疗法（光疗、电刺激等）的理想工具。

五、局限性

1. 物种差异： 大鼠皮肤结构、愈合机制与人类存在差异（如大鼠伤口收缩作用更强）。
2. STZ毒性： STZ可能对肝、肾等其他器官产生一定毒性，需注意观察非靶效应。
3. 创面位置： 背部溃疡与人类好发于下肢（足部）的糖尿病溃疡在生物力学、局部微环境上有所不同。
4. 感染控制： 开放创面存在继发感染风险，需加强饲养管理和观察。
5. 模型复杂度： 仅模拟了缺血再灌注这一种诱因，而临床糖尿病溃疡常是多因素（神经病变、血管病变、感染、创伤）共同作用的结果。可结合其他方法（如坐骨神经压榨模拟神经病变）构建更复杂模型。

六、结论

大鼠 I 型糖尿病皮肤溃疡模型，特别是通过链脲佐菌素诱导糖尿病状态后结合缺血再灌注损伤（如磁铁压迫法）创建皮肤溃疡，是一种成熟、稳定且应用广泛的实验模型。它能较好地模拟糖尿病代谢紊乱下皮肤损伤修复障碍的核心病理特征，为深入探索糖尿病皮肤溃疡的发病机制、筛选潜在的治疗靶点以及评价各种新型治疗策略的有效性和安全性提供了不可或缺的临床前研究平台。研究人员在使用该模型时，应充分理解其优势和局限性，结合具体研究目的进行合理的设计和严谨的评价。

参考文献： (此处应列出构建和评价该模型所依据的关键文献，遵循学术规范)