大鼠缺血性/出血性脑卒中模型

大鼠缺血性/出血性脑卒中模型构建完整指南

脑卒中作为全球致残致死的主要原因，其病理机制和治疗研究高度依赖动物模型。大鼠因其神经系统与人类相似、成本可控、操作便利等优势，成为最常用的模型动物。本指南旨在系统阐述大鼠缺血性及出血性脑卒中模型的建立流程、评价方法与注意事项。

一、 模型概述与意义

• 缺血性脑卒中模型： 模拟脑血管阻塞导致的脑组织缺血坏死，占临床病例约85%。核心目标是再现局部脑血流中断及缺血级联反应。
• 出血性脑卒中模型： 模拟脑血管破裂导致的脑实质内出血，占临床病例约15%。核心目标是模拟血肿形成及其对周边脑组织的压迫、毒性损伤。
• 模型价值： 精准模拟人脑卒中病理过程，为研究发病机制、探索神经保护策略、评估新型药物及治疗手段提供不可或缺的平台。

二、 缺血性脑卒中模型建模方法

• 1. 大脑中动脉阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）

  • 原理： 通过机械或化学手段阻断大脑中动脉（MCA）血流，模拟最常见的缺血性卒中类型。
  • 方法分类：
    • 永久性MCAO（pMCAO）： 阻断后不再恢复血流，模拟不可逆血管闭塞（如动脉粥样硬化血栓栓塞）。
    • 短暂性MCAO（tMCAO）： 阻断一段时间后恢复血流，模拟溶栓治疗后再通或一过性栓塞。
  • 操作步骤（以线栓法为例）：
    1. 麻醉与准备： 大鼠吸入或腹腔注射适宜麻醉剂（如异氟烷）。颈部备皮消毒。
    2. 颈动脉暴露： 颈部正中切口，分离肌肉暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。
    3. 血管处理： 结扎并离断ECA及其分支。CCA近心端夹闭，ICA远心端用动脉夹临时阻断。
    4. 插栓： 在CCA靠近分叉处剪小口，将特定直径（通常0.26-0.28mm）的硅胶涂覆尼龙线栓经CCA、ICA分叉处插入ICA，轻柔推进约18-22mm（成年SD大鼠）至遇到轻微阻力。此时线栓头端应位于MCA起始部，阻断MCA血流。
    5. 固定与闭合： 结扎固定线栓于CCA。移除ICA动脉夹。分层缝合颈部肌肉和皮肤。
    6. 再灌注（tMCAO）： 达到预定缺血时间（常用60-120分钟）后，大鼠二次麻醉，重新暴露颈部切口，小心抽出线栓恢复ICA血流。缝合切口。
  • 验证： 激光多普勒血流仪监测脑皮层血流显著下降；术后神经功能缺损评分；TTC染色确认梗死灶。
  • 优缺点：
    • 优点： 梗死灶位置、大小相对一致，可精确控制缺血时间（tMCAO），操作技术成熟。
    • 缺点： 手术创伤，需熟练显微操作技术，存在蛛网膜下腔出血风险，梗死灶范围存在个体差异。

• 2. 血栓栓塞模型

  • 原理： 模拟临床最常见的心源性或动脉源性血栓脱落栓塞远端脑血管。
  • 方法分类：
    • 自体血栓栓塞： 抽取自体静脉血体外诱导形成血凝块，注射入颈内动脉或颈总动脉。
    • 光化学诱导血栓： 静脉注射光敏剂（如玫瑰红B），特定波长激光照射目标血管（如颅骨开窗暴露MCA），激活光敏剂引发内皮损伤和血栓形成。
  • 操作要点：
    • 自体血栓： 制备均匀细小血栓颗粒，通过导管注入ICA。梗死灶位置和大小变异较大。
    • 光化学法： 需颅骨开窗，精确定位照射目标血管。可形成稳定的原位血栓。
  • 验证： 血管造影证实栓塞；行为学缺陷；组织学梗死。
  • 优缺点：
    • 优点： 更接近临床血栓形成机制（尤其光化学法）。
    • 缺点： 操作更复杂（光化学法需开颅），梗死灶变异性大（尤其自体血栓模型），成功率相对较低。

三、 出血性脑卒中模型建模方法

• 1. 胶原酶诱导模型

  • 原理： 向脑内靶区立体定向注射胶原酶（通常为Ⅶ型），酶解血管基底膜Ⅳ型胶原，导致血管破裂出血。
  • 操作步骤：
    1. 麻醉与固定： 大鼠深度麻醉，固定于立体定位仪上。
    2. 颅骨暴露与定位： 头皮正中切口，暴露颅骨。以前囟（Bregma）为原点，根据图谱确定目标核团（常用尾壳核）坐标（如：前囟前1.0mm，中线旁3.0-3.5mm，硬膜下5.0-6.0mm）。
    3. 颅骨钻孔： 在目标坐标点钻孔，小心保持硬脑膜完整。
    4. 胶原酶注射： 微量注射器（如Hamilton注射器）连接细针头（26-33G），吸取溶解于生理盐水或PBS中的胶原酶溶液（浓度0.2-0.5 U/μl，体积0.5-2.0μl）。缓慢垂直进针至目标深度。以极慢速度（如0.1-0.2μl/min）注射胶原酶溶液。注射完毕，留针5-10分钟，缓慢退针。
    5. 缝合与恢复： 骨蜡封闭骨孔，缝合头皮切口。大鼠保温复苏。
  • 验证： MRI或CT显示血肿；组织学（如H&E染色）观察血肿及周围水肿；脑组织血红蛋白含量测定；神经功能评分。
  • 优缺点：
    • 优点： 操作相对简单，出血过程相对可控（通过酶浓度和体积调节），血肿形成规律（初期快速扩大，后逐渐稳定）。
    • 缺点： 胶原酶本身具有神经毒性，可能引入额外变量；血肿由持续渗血形成，与临床急性血管破裂略有不同。

• 2. 自体血注射模型

  • 原理： 将自体动脉血直接注入脑实质，模拟急性血管破裂。
  • 操作步骤：
    1. 采血： 麻醉大鼠，无菌操作下暴露并穿刺股动脉或尾动脉，抽取所需体积（常用50-100μl）的自体非肝素化血液，迅速置于微量注射器中避免凝固。
    2. 立体定位注射： 同胶原酶模型步骤1-3，定位至目标核团（如尾壳核）。将血液缓慢（通常10-20μl/min）注射至目标位置。注射完毕，留针数分钟防止反流。
    3. 缝合与恢复： 同胶原酶模型步骤5。
  • 验证： 同胶原酶模型。
  • 优缺点：
    • 优点： 最接近临床脑出血的急性过程；不含外源酶类，干扰因素少。
    • 缺点： 血肿大小和形态受注射速度和压力影响较大，重复性相对胶原酶法稍差；注射过快或压力过高易导致血液顺针道反流或进入脑室系统，影响模型稳定性；操作时间要求更严格（血液易凝）。

四、 模型评价标准

• 1. 神经功能缺损评分：

  • 常用量表： Longa评分（5分制）、Bederson评分（侧重姿势反射）、Garcia评分（多维度综合评价，包括运动、感觉、反射等）。
  • 评估时机： 术后即时、24小时、48小时、72小时及更长时间点进行定期评估，观察恢复轨迹。

• 2. 组织病理学评估：

  • 梗死体积（缺血模型）：
    • TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色： 术后24-72小时取脑，冠状位切片（厚度1-2mm），37℃避光孵育TTC溶液15-30分钟。正常脑组织染成红色，梗死区呈白色。拍照后用图像分析软件计算梗死体积占比。
    • HE染色（常规形态学）： 观察神经元坏死、核固缩、炎细胞浸润等。
  • 血肿体积与周围损伤（出血模型）：
    • 直接测量/成像： 术后24小时取脑，可肉眼观察测量血肿大小，或通过MRI/CT扫描精确量化体积。
    • 组织学（H&E染色）： 明确血肿位置、大小，观察血肿周围水肿带、炎症反应、神经元损伤程度。
    • 脑含水量测定（干湿重法）： 定量评估脑水肿严重程度。
    • 血红蛋白含量测定： 定量反映出血量。

• 3. 影像学评估（可选但推荐）：

  • MRI： T2WI显示水肿，DWI显示急性缺血损伤，T2*WI/GRE/SWI显示出血灶（顺磁性效应）。可无创、动态观察病灶演变。
  • CT： 清晰显示急性期高密度血肿（出血模型），对缺血早期改变敏感性低于MRI。

• 4. 分子生物学检测（机制研究）：

  • 检测炎症因子（IL-1β, TNF-α）、凋亡相关蛋白（Bcl-2, Bax, Caspase-3）、氧化应激指标（SOD, MDA）等在病灶及周边组织的表达变化。

五、 模型选择与注意事项

• 模型选择依据：

  • 研究目标： 研究缺血机制/再灌注损伤/神经保护 → tMCAO/pMCAO；研究脑出血后血肿扩大/水肿/炎症 → 胶原酶/自体血ICH模型；研究溶栓/取栓治疗 → tMCAO或血栓栓塞模型；研究止血/血肿清除 → ICH模型。
  • 可操作性： MCAO线栓法技术成熟应用广；自体血ICH操作要求高；光化学法设备要求高。
  • 一致性需求： MCAO和胶原酶ICH模型相对稳定；自体血ICH和血栓栓塞模型个体差异可能稍大。

• 关键注意事项：

  1. 动物福利与伦理： 实验方案必须通过所在机构伦理委员会审批。严格遵循“3R”原则（替代、减少、优化）。提供充分镇痛（如术后布托啡诺或布洛芬）。保持环境舒适（温度、湿度、垫料），避免应激。设定明确的人道终点标准并及时执行安乐死。
  2. 麻醉管理： 选择适宜麻醉剂（如异氟烷吸入麻醉可控性好），监测麻醉深度（如足趾夹捏反射），维持体温（37±0.5℃，使用加热垫），避免缺氧。
  3. 无菌操作： 手术器械严格消毒灭菌，术区充分消毒，操作者穿戴无菌手套、口罩、帽子，最大限度降低术后感染风险。
  4. 操作熟练度： 显微外科手术（尤其MCAO）和立体定位注射需要大量训练以达到稳定成功率。初学者应在经验丰富者指导下练习。
  5. 术后护理： 单笼饲养直至清醒。提供柔软垫料和易获取的水食（如湿润饲料）。密切观察生命体征、神经症状、切口情况至少24-48小时。必要时补充生理盐水。
  6. 标准化： 尽量固定操作者、动物品系周龄体重、手术时间、试剂批次、环境条件等，减少系统误差。
  7. 假手术组： 除关键手术步骤（如插栓、注射酶/血）外，其余操作（麻醉、切口、血管暴露、颅骨钻孔、甚至注射载体溶液）均相同，以排除手术创伤本身的影响。
  8. 样本量： 根据预实验结果和统计学要求计算足够样本量，考虑模型成功率和可能的损耗。

六、 结论

大鼠缺血性和出血性脑卒中模型是研究脑卒中病理生理机制和探索治疗干预措施的核心工具。MCAO线栓法和胶原酶/自体血脑内注射法是当前应用最广泛的主流模型。成功建立这些模型需要严谨的实验设计、熟练规范的操作技术、客观全面的评价体系以及高度的动物伦理意识。研究者应根据具体科学问题，权衡各模型的优缺点，选择最适宜的模型，并严格遵循操作规范和伦理要求，才能获得可靠、可重复的研究结果，有效推动脑卒中研究的进步。

注意： 本指南基于当前常用方法学文献综述，具体实验参数的确定（如麻醉剂用量、线栓尺寸、胶原酶浓度体积、注射速度、评价时间点等）需研究者查阅最新、最相关的原始研究文献进行优化确认，并进行充分的预实验验证。