OVA诱导的大鼠、豚鼠哮喘模型

OVA诱导的大鼠与豚鼠哮喘模型：原理、方法与应用

摘要： 卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘模型是研究过敏性哮喘发病机制、炎症通路及潜在治疗策略的核心实验工具。大鼠模型以其稳定的Th2免疫反应见长，而豚鼠模型则更贴近人类哮喘的气道高反应性特征。本文系统阐述OVA模型的构建原理、标准化操作流程、关键评价指标及模型局限性，为哮喘研究提供方法学参考。

一、引言 过敏性哮喘以慢性气道炎症、可逆性气流阻塞及气道高反应性（AHR）为特征。OVA作为强免疫原性抗原，可在大鼠和豚鼠中成功模拟人类哮喘的关键病理生理学改变。该模型因其可重复性好、操作相对简便且病理特征明确，成为哮喘基础与转化研究的重要平台。

二、模型构建原理 OVA模型基于“致敏-激发”的两阶段策略：

1. 致敏期： OVA联合免疫佐剂（如氢氧化铝）注射，打破免疫耐受，诱导抗原特异性IgE产生，致敏Th2淋巴细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
2. 激发期： 雾化吸入OVA，触发致敏细胞活化，释放炎症介质（组胺、白三烯、细胞因子），募集炎症细胞（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞），导致急性支气管收缩、黏液高分泌、血管通透性增加及慢性气道炎症和重塑。

三、标准化操作流程

• 1. 实验动物准备：

  • 物种选择：
    • 大鼠 (常用品系：Brown Norway, Sprague-Dawley, Wistar)： Th2型炎症反应典型，嗜酸性粒细胞浸润显著，适用于免疫机制、抗炎药物研究。成本较低，操作相对简便。
    • 豚鼠： 气道平滑肌对介质（如组胺、乙酰甲胆碱）高度敏感，AHR表现突出，更接近人类哮喘的气道痉挛特性。适用于支气管扩张剂、气道反应性研究。IgE介导的速发型反应显著。
  • 饲养： SPF级环境，自由饮水和标准饲料，适应环境至少1周。
  • 分组： 随机分为正常对照组（NS组）和OVA哮喘模型组（OVA组），必要时设治疗对照组。每组通常6-8只。

• 2. 致敏阶段：

  • 方案：
    • 大鼠： 第1天和第8天，腹腔注射含OVA（常用100μg-1mg）和佐剂（如铝佐剂100-200mg）的混悬液，体积通常0.2-1mL。
    • 豚鼠： 第1天和第3天（或第1天、第3天、第5天），腹腔或皮下注射OVA（常用10-100μg）与佐剂（如铝佐剂10-100mg）混悬液，体积通常0.1-0.5mL。豚鼠可能需要更高频率或剂量致敏。
  • 关键点： 佐剂选择与剂量对诱导有效Th2反应至关重要。注射部位严格消毒。

• 3. 激发阶段：

  • 时间： 致敏结束后1-2周（通常第15天或第22天左右开始）。
  • 方法： 雾化吸入OVA溶液（常用1-5% w/v，溶于无菌生理盐水）。
  • 方案：
    • 大鼠： 连续5-7天（或隔天），每天20-30分钟。
    • 豚鼠： 连续3-5天（或隔天），每天15-20分钟。豚鼠气道敏感性高，需密切监视急性反应。
  • 设备： 专用雾化箱，确保气溶胶浓度恒定均匀，换气良好。激发后严密观察动物状态（呼吸频率、活动度）。

• 4. 对照组处理：

  • NS组： 致敏和激发均使用等体积无菌生理盐水代替OVA乳液或溶液，操作流程与OVA组完全一致。

四、模型评价指标

• 1. 气道功能评估：

  • 气道高反应性 (AHR)： 核心指标。 末次激发后24-48小时进行（避免急性支气管收缩干扰）。
    • 方法： 麻醉动物（常用乌拉坦或戊巴比妥钠），气管插管连接体描箱或无创气道功能仪。
    • 刺激： 雾化吸入梯度浓度支气管收缩剂（乙酰甲胆碱或组胺）。
    • 检测： 记录气道阻力（Raw）、肺动态顺应性（Cdyn）、呼气峰流速（PEF）、增强呼吸间歇（Penh - 无创指标）等参数的变化。绘制剂量/浓度-反应曲线，计算引起指标变化百分比达到预设值（如Raw增加200%， PC200）所需的激发剂浓度/剂量。豚鼠AHR通常更显著。
  • 肺功能 (可选)： 部分设备可测量更全面的肺功能参数。

• 2. 气道炎症评估：

  • 支气管肺泡灌洗液 (BALF) 分析： 处死动物后行气管插管，灌入预冷无菌生理盐水（大鼠3-5mL×3次，回收率>80%；豚鼠5-10mL×3次），回收BALF。
    • 细胞计数与分类： 离心后重悬细胞，台盼蓝染色计数总细胞数，瑞氏-吉姆萨染色或Diff-Quik染色进行细胞分类（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞计数及比例）。OVA组嗜酸性粒细胞显著升高是成功建模的关键标志。
  • 肺组织病理学： 金标准。 取肺组织固定（常用4%多聚甲醛）、石蜡包埋切片。
    • 染色：
      • H&E染色： 评估炎症细胞浸润（支气管/血管周围袖套状浸润）、气道壁增厚、上皮损伤/脱落。
      • PAS染色： 评估杯状细胞增生/化生、黏液分泌过多及黏液栓形成。
    • 评分： 采用半定量评分系统对炎症程度、黏液分泌等进行评估。

• 3. 免疫学与分子生物学指标：

  • 血清学： 检测OVA特异性IgE、IgG1水平（ELISA法）。
  • 细胞因子/趋化因子： 检测BALF、肺组织匀浆液或体外培养的脾/淋巴结细胞上清中Th2相关因子（IL-4, IL-5, IL-13）、Th1相关因子（IFN-γ）、Th17相关因子（IL-17A）、促炎因子（TNF-α）及嗜酸性粒细胞趋化因子（如eotaxin/CCL11）水平（ELISA, Luminex, qPCR）。
  • 肺组织基因表达： qPCR检测炎症因子、黏蛋白基因（MUC5AC）等mRNA表达。

五、模型特点与局限性

• 优点：
  • 病理特征明确（嗜酸性炎症、黏液分泌、AHR）。
  • 可重现过敏性哮喘的Th2免疫反应。
  • 操作相对标准化，成本可控。
  • 大鼠模型适用于免疫机制和高通量药物筛选。
  • 豚鼠模型在气道反应性方面更具优势。
• 局限性：
  • 与人类哮喘的差异： 人类哮喘具有高度异质性（如非嗜酸型哮喘），诱因复杂多变（多抗原、环境触发），且通常存在慢性气道重塑。OVA模型是急性/亚急性模型，慢性重塑特征不如某些慢性模型（如屋尘螨模型）明显。
  • 种属差异： 大鼠、豚鼠的免疫系统和气道解剖生理与人类存在差异。
  • 佐剂依赖： 佐剂本身可能产生非特异性免疫刺激。
  • 急性模型为主： 需要优化方案（如延长激发期、降低OVA浓度激发）来模拟慢性特征。

六、结论

OVA诱导的大鼠和豚鼠哮喘模型是研究过敏性哮喘病理生理机制和评价潜在治疗干预措施不可或缺的工具。大鼠模型在Th2炎症研究方面优势突出，而豚鼠模型在气道高反应性评估上更贴近临床。研究者需根据具体科学问题（侧重免疫机制还是气道功能）谨慎选择模型物种，并严格遵循标准化操作流程和伦理规范（包括动物福利和伦理审查）。理解该模型的优势和局限性对于准确阐释实验结果并推进其向临床应用转化至关重要。通过结合多种模型（如OVA模型与其他过敏原如屋尘螨模型）或采用慢性化方案，可更全面地模拟人类哮喘的复杂特性。

附录：示意图示例 (文字描述)

• 图1：OVA哮喘模型建立流程图

  实验动物 (大鼠/豚鼠) ↓ (适应期 ≥7天) 随机分组 (Control组 vs OVA组) ↓ (致敏期: 第1天, 第8天[大鼠] / 第1,3,5天[豚鼠]) 腹腔注射: OVA + 佐剂 (vs 生理盐水) ↓ (致敏后休息期: 1-2周) 雾化吸入激发: OVA溶液 (连续数天) (vs 生理盐水) ↓ (激发后24-48小时) 终点检测: AHR测定、BALF收集、组织取材...

• 图2：典型病理改变示意图

  • 正常气道： 气道上皮完整，杯状细胞稀少，黏膜下层薄，平滑肌层正常，无炎症细胞浸润，管腔通畅无黏液。
  • OVA模型气道：
    • 气道上皮部分损伤/脱落。
    • 杯状细胞显著增生、肥大（PAS染色阳性）。
    • 黏液分泌增多，管腔内可见黏液栓。
    • 黏膜下层增厚（水肿、胶原沉积、新生血管）。
    • 气道平滑肌增生、肥大。
    • 支气管/血管周围大量炎症细胞（主要为嗜酸性粒细胞，伴中性粒、淋巴、单核细胞）浸润（袖套状）。
    • 基底膜增厚（需特殊染色显示）。

请注意： 实际实验设计中所有试剂配制、动物操作及处死方法均需严格遵守所在机构动物伦理和使用委员会（IACUC或类似机构）批准的实验方案。