大鼠、兔肝纤维化模型

大鼠与兔肝纤维化模型：原理、建立与应用

肝纤维化是慢性肝损伤后过度的瘢痕组织沉积过程，最终可进展为肝硬化及肝功能衰竭。研究其发生机制与探索有效干预措施，高度依赖于可靠且可重复的动物模型。大鼠和兔是肝纤维化研究中最常用的哺乳动物模型之一，各具特点。

一、 大鼠肝纤维化模型

大鼠因其体型适中、繁殖周期短、成本相对较低、遗传背景相对清晰、对多种诱导因素敏感，成为应用最广泛的肝纤维化模型动物。

1. 常用建模方法：

   • 化学诱导法：
     • 四氯化碳： 经典且应用最广。常用途径为腹腔注射或皮下注射含有四氯化碳的油溶液（如橄榄油、矿物油）。通常每周给药2次，持续数周（4-12周或更长）。原理是四氯化碳经肝脏细胞色素P450代谢产生活性自由基，导致肝细胞膜脂质过氧化和坏死，持续损伤激活肝星状细胞，启动纤维化进程。模型稳定，纤维化程度与给药剂量、频率和持续时间正相关。
     • 二甲基亚硝胺： 主要通过腹腔注射给药。DMN具有强肝毒性，能快速诱导肝细胞坏死、炎症和显著的纤维间隔形成。建模周期相对较短（3-4周），纤维化程度较重，但毒性也较大，动物死亡率较高，需严格控制剂量和给药方案。
     • 硫代乙酰胺： 可通过腹腔注射、皮下注射或饮水给药。TAA在肝内经代谢转化为硫代乙酰胺-S-氧化物，引起肝细胞坏死和胆汁淤积，继而导致纤维化。建模周期中等（6-10周），纤维化进展相对稳定。
   • 胆管结扎法：
     • 通过手术结扎胆总管，造成肝外胆汁淤积。该模型能较好地模拟胆汁淤积性肝病（如原发性胆汁性胆管炎、胆道闭锁等）相关的纤维化进程。通常在术后2-4周即可形成明显的胆管增生和门脉区纤维化。模型成功率高，纤维化形成快，但手术创伤本身是额外因素，且动物需精心护理。
   • 复合因素法：
     • 常采用化学诱导物（如CCl4）联合其他因素（如高脂饮食、乙醇饮水）以模拟更复杂的病因（如脂肪性肝炎纤维化、酒精性肝纤维化）。

2. 模型特点与评价：

   • 优点： 技术成熟，方法多样，成本可控，重复性较好，肝组织样本量充足便于各类检测。存在大量历史数据和公认的评价标准。
   • 缺点： 建模周期相对较长（化学法），不同品系对诱导剂敏感性有差异。单一化学诱导模型可能不完全模拟人类肝病的复杂病理生理过程。胆管结扎模型主要反映胆汁淤积性纤维化。

二、 兔肝纤维化模型

兔体型比大鼠大，部分生理特点（如脂质代谢）更接近人类，且血浆/血清样本量更大，适用于需要多次采血或特定检测的研究。

1. 常用建模方法：

   • 化学诱导法：
     • 四氯化碳： 同样是兔肝纤维化建模的主流方法。常用途径为皮下注射其油溶液。给药频率和周期需根据品系和实验设计调整，通常也需要数周时间。新西兰白兔是最常用品系。
     • 酒精联合高脂饲料： 通过灌胃给予乙醇溶液并饲喂高脂饲料，可尝试模拟酒精性脂肪性肝炎及其纤维化进程，但单纯用酒精在兔上诱导纤维化通常较困难且周期长，常需联合其他因素。
   • 胆管结扎法：
     • 手术原理与大鼠相同。兔体型更大，手术操作相对容易，但术后护理要求高。能快速诱导胆汁淤积性纤维化。
   • 高胆固醇/胆酸饲料： 长期饲喂高胆固醇或胆酸饲料，可在部分易感品系兔中诱导脂肪变性和一定程度的炎症及纤维化，尤其适用于研究胆固醇代谢紊乱相关的肝病（如非酒精性脂肪性肝炎的部分机制）。

2. 模型特点与评价：

   • 优点： 体型更大，便于多次采血监测动态指标，获取更大组织样本；某些代谢特征（如脂蛋白谱、胆固醇代谢）比啮齿类更接近人类；适用于特定的外科操作或影像学研究。
   • 缺点： 成本显著高于大鼠（购买、饲养、耗材、药品用量等）；建模周期通常更长；繁殖速度慢，品系选择相对有限；麻醉和管理风险高于大鼠（兔对麻醉剂敏感，易发生应激反应）；在纤维化研究领域积累的数据和标准化程度不如大鼠模型丰富。

三、 肝纤维化模型的关键评价指标

无论使用大鼠或兔模型，评估肝纤维化程度和模型成功与否需结合多方面指标：

1. 血清生化指标： 丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶（肝损伤标志）；总胆红素、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶（胆汁淤积/胆管损伤标志）；白蛋白、凝血酶原时间（肝功能储备标志）。这些指标在建模过程中通常会升高（白蛋白降低）。
2. 组织病理学检查（金标准）：
   • 苏木素-伊红染色： 评估肝细胞损伤、坏死、炎症浸润（汇管区、小叶内）、脂肪变性等。
   • 特殊染色（核心评价）：
     • 天狼星红染色/马松三色染色： 特异性显示胶原纤维（呈红色/蓝色），是定量评估纤维化沉积面积和分布（汇管区、窦周、桥接纤维化、假小叶形成）的最可靠方法。常用半定量评分系统（如Ishak, METAVIR, Scheuer评分系统）。
   • 免疫组织化学/免疫荧光染色： 检测活化肝星状细胞标志物（如α-平滑肌肌动蛋白）、胶原类型（I型胶原蛋白、III型胶原蛋白）、炎症细胞标志物、增殖细胞核抗原等，从分子水平揭示纤维化机制。
3. 羟脯氨酸含量测定： 胶原蛋白富含羟脯氨酸，通过化学方法测定肝组织匀浆中羟脯氨酸含量可定量反映总胶原沉积量，是天狼星红染色的重要补充。
4. 分子生物学检测： 实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法检测纤维化相关基因（胶原蛋白I/III、α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子-β1、基质金属蛋白酶及其抑制因子等）在mRNA和蛋白水平的表达变化。
5. 影像学评估（可选）： 超声（观察肝脏形态、回声）、瞬时弹性成像（如FibroScan，无创评估肝脏硬度，但小型动物应用受限）等在部分研究中用于活体监测纤维化进展。

四、 模型选择与实验注意事项

• 研究目的决定模型选择：
  • 研究一般肝纤维化机制、药物筛选（成本、样本量需求大），大鼠模型（尤其是CCl4模型）通常是首选。
  • 研究胆汁淤积性肝纤维化，胆管结扎模型（大鼠或兔）更直接。
  • 研究脂代谢紊乱相关肝纤维化，兔的高胆固醇/胆酸饲料模型或大鼠的复合模型（高脂+CCl4/其他）可能更合适。
  • 需要频繁大量取样血液进行动态监测或特定代谢研究，兔模型优势明显。
• 品系选择： 不同品系对诱导剂的敏感性和基础状态有差异（如SD大鼠与Wistar大鼠，新西兰白兔与其他兔种）。应选择文献报道稳定、背景清晰的品系。
• 严格对照： 必须设立溶剂对照组（如注射用油）、假手术组（胆管结扎模型）或正常饲料组，以排除非处理因素的影响。
• 人道终点与伦理： 密切观察动物状态（体重下降、活动减少、萎靡、黄疸等），设定科学合理的人道终点，避免不必要的痛苦。所有实验必须遵循动物实验伦理指南并获得伦理委员会批准。
• 标准化操作： 保证诱导剂浓度、给药途径、频率、剂量的准确性和一致性；手术操作规范熟练；饲养环境稳定（温度、湿度、光照周期、饲料、饮水）。
• 样本采集与处理： 规范取材（固定部位、尺寸），确保组织固定（如中性福尔马林）及时充分，避免自溶影响后续染色和分子检测结果。

五、 总结

大鼠和兔肝纤维化模型是研究肝纤维化发病机制、病理生理变化及评估潜在抗纤维化疗法的有力工具。大鼠模型以其经济性、技术成熟度和广泛应用性见长；兔模型则在样本量需求、特定代谢研究和某些手术操作方面具有独特价值。研究者在选择模型时需充分考虑研究目标、成本、实验周期、技术可行性及动物福利等因素，并严格遵守标准化操作规范和伦理要求，才能获得可靠、可重复的实验数据，从而有效推进对肝纤维化这一重大健康问题的认识和治疗进展。

关键要点回顾：

• 大鼠模型： 主流（CCl4, DMN, TAA, BDL），经济、成熟、样本足，首选通用模型。
• 兔模型： 体型大、血样多、脂代谢近人（高胆固醇/胆酸模型），成本高、周期长、管理难，用于特定需求。
• 评价核心： 血清生化（损伤/功能）+ 组织病理（天狼星红/马松染色 + H&E 金标准）+ 羟脯氨酸（胶原定量）+ 分子检测（机制）。
• 选择依据： 研究目的、成本、周期、样本需求、物种特性。
• 成功关键： 标准化操作、严格对照、伦理合规、规范取材处理。