OVA诱导的过敏性鼻炎小鼠/大鼠模型构建完整方案
摘要： 卵清蛋白（OVA）模型是研究过敏性鼻炎（AR）发病机制及评估干预措施的金标准。本文详细描述了OVA诱导小鼠和大鼠AR模型的标准化流程、评价方法及注意事项。
一、 模型原理
通过系统性致敏（腹腔注射）结合局部激发（鼻腔滴注），使实验动物对OVA产生特异性IgE介导的I型超敏反应，模拟人类AR的典型病理特征：鼻痒、喷嚏、流涕及鼻黏膜炎症细胞（嗜酸性粒细胞为主）浸润。
二、 材料与试剂
- 实验动物：
- 小鼠： BALB/c (首选，高反应性)， C57BL/6（需更高剂量/佐剂）等，6-8周龄，雌雄均可（通常雌性更敏感）。
- 大鼠： SD或Wistar大鼠，6-8周龄。
- 饲养于SPF环境，自由饮水进食；实验前伦理审查通过。
- 主要试剂：
- 致敏原: 卵清蛋白（OVA，Grade V或更高纯度）。
- 佐剂：
- 致敏阶段： 氢氧化铝凝胶（明矾），或完全弗氏佐剂（初次注射）+不完全弗氏佐剂（加强注射）。
- 激发阶段： 不使用佐剂。
- 溶剂: 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水。
- 染色/检测试剂： 瑞氏-吉姆萨染液、HE染液、甲苯胺蓝染液（肥大细胞）、PAS染液（杯状细胞）、相关ELISA试剂盒（OVA特异性IgE, 总IgE, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ等）。
- 主要设备: 精密电子天平、振荡器、涡旋混合器、离心机、微量移液器及无菌吸头、动物固定器、计时器、光学显微镜、酶标仪、石蜡切片机等。
三、 模型构建步骤
(一) 致敏阶段（系统免疫）
- 溶液配制：
- OVA/佐剂混合液：
- 小鼠：
- 明矾佐剂法： OVA溶解于PBS (100 μg/只)，与等体积氢氧化铝凝胶（2mg Al³⁺/只）充分混匀吸附（室温震荡≥1h或4℃过夜）。
- 弗氏佐剂法： OVA溶解于PBS (10-20 μg/只)，与等体积完全弗氏佐剂（初次）或不完全弗氏佐剂（加强）乳化至油包水状态（水滴滴入不分散）。
- 大鼠：
- 明矾佐剂法： OVA (1mg/只) + 氢氧化铝凝胶（10-20mg Al³⁺/只）。
- 弗氏佐剂法： OVA (100 μg-1mg/只) + 相应佐剂。
- 小鼠：
- 对照组溶液： 仅含佐剂（同体积）的PBS溶液。
- OVA/佐剂混合液：
- 致敏注射：
- 时间点： 第0、7、14天（经典三针法，可调整）。
- 途径： 腹腔注射 (i.p.)。
- 体积：
- 小鼠：0.2 mL/只。
- 大鼠：0.5-1.0 mL/只。
- 分组： OVA致敏组（OVA/Alum 或 OVA/IFA）、佐剂对照组（Alum/PBS 或 IFA/PBS）、空白对照组（如仅PBS）。
(二) 激发阶段（局部诱导鼻炎症状）
- 溶液配制：
- OVA激发液: OVA溶解于PBS。
- 小鼠： 1%-5% (w/v)，常用 2.5% 或 5%。
- 大鼠： 5%-10% (w/v)，常用 5% 或 8%。
- 对照组激发液： PBS。
- OVA激发液: OVA溶解于PBS。
- 激发时间点： 通常在末次致敏后7天开始（约第21天）。
- 激发方式：
- 鼻腔滴注：
- 动物准备： 轻度麻醉（如异氟烷吸入）或熟练操作下无麻醉固定（捏住颈背部皮肤，动物鼻孔朝天）。
- 滴注操作： 使用微量移液器将激发液滴入双侧鼻孔。
- 小鼠： 10 μL/鼻孔/次 (共20μL/只)。
- 大鼠： 20-30 μL/鼻孔/次 (共40-60μL/只)。
- 注意事项： 保证液体吸入鼻腔而非流入咽部（滴速慢，观察吸入动作），动物保持仰头姿势数秒。
- 激发频率: 连续5-7天，每天1次（第21-25天或21-27天）。首次激发后30分钟内密切观察急性反应（搔鼻、喷嚏）。
- 鼻腔滴注：
(三) 行为学症状观察与评分
- 观察时间： 每次鼻腔激发后 10分钟内 (急性症状高峰期)。
- 观察指标与评分标准（示例）：
- 搔鼻次数： 前爪快速擦拭鼻部或鼻周区域。
- 0分：0次；1分：1-5次；2分：6-10次；3分：11-15次；4分：>15次。
- 喷嚏次数： 可听到的爆发性喷气声。
- 0分：0次；1分：1-3次；2分：4-6次；3分：7-10次；4分：>10次。
- 流涕程度： 观察鼻孔分泌物（清水样）。
- 0分：无；1分：单侧鼻孔微量湿润；2分：双侧鼻孔湿润或有少量分泌物溢出；3分：分泌物较多，覆盖鼻孔周围；4分：大量分泌物，流至面部。
- 搔鼻次数： 前爪快速擦拭鼻部或鼻周区域。
- 记录： 每次激发后独立观察者盲法记录评分。通常计算最后1-3次激发的平均分作为个体症状评分。
(四) 样本采集与检测（通常在末次激发后24-48小时进行）
- 血液采集：
- 途径： 摘眼球取血（小鼠），或麻醉后心脏/腹主动脉采血（大鼠）。
- 处理： 静置或离心分离血清，-80℃保存。
- 检测：
- 血清OVA特异性IgE： ELISA法（模型成功关键指标）。
- 血清总IgE： ELISA法。
- Th2/Th1细胞因子： ELISA检测血清或鼻灌洗液中IL-4, IL-5, IL-13 (Th2)， IFN-γ (Th1)水平。
- 鼻粘膜组织：
- 获取：
- 安乐死： 过量麻醉或CO₂吸入。
- 解剖： 小心剥离鼻骨，取出包含鼻甲、鼻中隔的完整鼻腔组织。
- 处理与固定： 立即投入4%多聚甲醛或10%中性福尔马林固定≥24小时。
- 脱钙（重要）： 固定后组织转入EDTA脱钙液（小鼠~3天，大鼠~7天，视骨化程度调整），期间更换脱钙液。
- 石蜡包埋与切片： 常规脱水、透明、浸蜡、包埋。沿鼻咽部冠状面连续切片（厚度4-5μm），选取包含筛鼻甲、上鼻甲的关键层面。
- 组织病理学染色与评价：
- HE染色： 观察整体结构、炎症细胞浸润（尤其嗜酸性粒细胞）。
- 评价： 在鼻甲黏膜固有层和上皮下层随机选取高倍视野（如400x），计数嗜酸性粒细胞数目。评价黏膜水肿、充血、上皮损伤情况。可进行半定量炎症评分（0-无，1-轻度，2-中度，3-重度）。
- 甲苯胺蓝染色： 特异性显示肥大细胞（颗粒呈紫红色）。
- 评价： 计数黏膜固有层肥大细胞数量（高倍视野）。
- PAS染色： 显示杯状细胞（黏液，呈紫红色）及黏液分泌。
- 评价： 计数鼻上皮中杯状细胞数量或测量上皮PAS阳性区域面积占比。
- 免疫组化/免疫荧光： 检测特定蛋白（如Eotaxin, IL-5, IgE受体）表达定位。
- HE染色： 观察整体结构、炎症细胞浸润（尤其嗜酸性粒细胞）。
- 获取：
- 鼻灌洗液：
- 收集： 安乐死前，气管插管结扎气管远端，从喉侧插入导管，缓慢注入并回抽预冷的PBS (小鼠：0.5-1mL；大鼠：1-2mL)，重复2-3次，收集灌洗液。
- 处理： 离心去除细胞碎片，上清液-80℃保存用于细胞因子检测。沉淀细胞重悬用于总数计数（血球计数板）和分类计数（细胞涂片，瑞氏-吉姆萨染色）。
- 评价： 灌洗液中总细胞数、嗜酸性粒细胞比例/绝对值、中性粒细胞比例/绝对值、巨噬细胞比例等。上清液中炎症因子水平。
四、 模型成功评价标准
- 行为学： OVA组动物在激发后出现显著增加的搔鼻、喷嚏、流涕症状（评分显著高于对照组）。
- 血清学： OVA组血清OVA特异性IgE和总IgE水平显著升高。
- 病理学：
- 鼻黏膜大量嗜酸性粒细胞浸润（HE染色证实）。
- 肥大细胞增多（甲苯胺蓝染色）。
- 杯状细胞增生及黏液分泌增加（PAS染色）。
- 黏膜水肿、血管扩张充血、上皮可能受损或增厚。
- 鼻灌洗液： 总细胞数显著增加，嗜酸性粒细胞比例/绝对值显著升高。
- 细胞因子： 血清或灌洗液中Th2型细胞因子（IL-4, IL-5, IL-13）升高，可能伴有Th1型细胞因子（IFN-γ）下降或不变。
五、 关键注意事项
- 动物福利与伦理： 严格遵守动物实验伦理规范，通过IACUC审查。操作轻柔，避免不必要的痛苦。密切观察激发后反应，严重呼吸困难动物需及时处理。
- OVA纯度与批次： 使用高纯度OVA（Grade V及以上），不同批次需预实验验证反应性。避免使用含内毒素的OVA。
- 佐剂选择：
- 明矾： 诱导强Th2反应，安全性相对较好，操作方便，推荐首选。
- 弗氏佐剂： 佐剂效应强，但注射部位易形成肉芽肿或溃疡，操作要求高（需充分乳化），动物耐受性差。
- 激发操作：
- 确保液体准确滴入鼻腔并被吸入。操作不当（流入咽部）会降低模型成功率且可能诱导气道反应甚至致死。
- 严格控制激发液浓度和体积，过高易导致严重气道痉挛。
- 初次激发需特别小心观察。
- 标准化与对照： 严格设置佐剂对照组（排除佐剂自身影响）和空白对照组。实验操作需标准化，减少人为差异（如固定、滴注手法、观察者）。
- 脱钙： 鼻骨脱钙必须彻底（用针轻戳确认），否则切片会损坏刀片并影响染色质量。
- 组织切片层面： 鼻甲结构复杂，需选取包含关键结构的相同解剖层面进行组织学比较。
- 评价指标全面性： 结合行为学、血清学、组织病理学和细胞学等多指标评价模型，结果更可靠。
六、 模型应用
OVA诱导的小鼠/大鼠AR模型广泛应用于：
- 过敏性鼻炎发病机制研究（Th2免疫偏移、嗜酸性粒细胞浸润、IgE产生、组织重塑）。
- 新型抗过敏药物（抗组胺药、白三烯受体拮抗剂、Th2细胞因子抑制剂、IgE抗体等）的药效学评价。
- 免疫调节疗法（如变应原特异性免疫治疗）的作用机制研究。
- 鼻腔给药系统的评价。
- 环境因素（如污染物、微生物）对AR影响的研究。
结论：